荧光的局限性和电子显微镜
当研究生物事件在一个细胞或分子水平的交互,科学家通常是有限的空间分辨率的调频。所谓的“超分辨率”方法在一定程度上克服这个限制,允许单个荧光标签的本地化分辨率达到几十纳米。调频也是有限的,因为它只看到荧光标记,不提供信息的结构和形态语境这个标志是观察。第二个限制也可能成为一种优势,因为它提供了特异性,允许标记分子识别的密集的海未标记的分子。
对比观察特定的标记分子,新兴市场看到当地的电子密度的差异。这使它理想的技术分析大分子复合物的结构或描述细胞形态和环境。在新兴市场然而,很难直接区分特定类型的分子。在CLEM实验中,调频和新兴市场在同一样本进行联系具体从调频或动态信息,用高分辨率或环境信息的新兴市场。
透射电镜样品制备和低温
理解的挑战CLEM需要审查的性质新兴市场样本。在透射电子显微镜(TEM),一个电子束照亮示例和投影图像记录。冲击试样时,加速电子交互和被吸收或散射。样品需要足够薄的电子束通过样例。由于真空显微镜中柱,样品还需要成像在干燥,固态不立即驱散到真空。
最常见的生物标本的制备方法TEM是按顺序替换所有的水样本通过树脂醇,然后嵌入聚合,导致固体块。这一块然后分段使用收益率片得足够薄的切片机TEM成像。增强的信号和对比新兴市场形象,电子致密物质如重金属染色样品制备过程中可以添加。
样品制备的另一个可能性是迅速冻结样品玻璃化所有所包含的水。这可以通过快速暴跌网格包含薄标本液化气体,如乙烷或通过使用高压冷冻设备后续低温解剖。这种技术的好处是,样品仍水化close-to-native状态和它的分子结构是最优保留。由此产生的“低温样品”可以成像新兴市场(这是低温新兴市场),提供他们在任何时候都保持在温度接近液态氮。
图像对比在低温新兴市场结果只从电子密度的差异之间的生物分子和周围的冰。因此,图像包括样品的分子结构信息。低温新兴市场可以实现决议< 5 nm单一图像。当结合计算平均方法,感兴趣的蛋白质的结构可以在最好的情况下解决0.3 nm的决议。
两种方法使饥饿
这取决于类型的新兴市场样品制备所使用,根据调频正在执行的类型,可以使用不同的CLEM形式。一种方法是进行活细胞荧光成像之前准备后续的样本新兴市场。这让一个典型的时间差距至少几秒钟的美国在调频和观察新兴市场由于时间损失而固定或固定样本。因此这一策略并不理想研究快速发展进程或一个非常精确的本地化的信号。第二种方法是执行新兴市场和调频相同的样品,一旦它已准备新兴市场。这个过程提供了相关精度高。第二种方法可以应用于样本嵌入在特定条件下树脂[1]。它也可以应用于低温样品——这是低温CLEM。
低温使饥饿的挑战和要求
低温的特别的挑战CLEM试样的温度必须保持-140°C以下,以避免形成水晶冰,,样品不能暴露在湿度,避免水的凝结。这些条件必须保持在所有阶段,包括在调频,虽然转移之间的样品样品制备设备,荧光显微镜,低温新兴市场装备TEM。
低温CLEM需要一个荧光显微镜配备一个特殊的低温阶段,保持低在成像样品温度。样品的低温阶段必须减少污染由于结霜从环境湿度。一个理想系统的光学性能应与高灵敏度实现高分辨率成像,使高精度相关性。
大量的低温阶段和相关的工作流开发低温CLEM。这些包括反向配置显微镜目标在哪里分开由载玻片样本以及直立设置使用长工作距离的目标。我们使用一个正直的显微镜配置和冷却目标方面,让我们的低温调频设置采用高钠与工作距离短,同时保持客观的标本玻化成功的低温CLEM。
使用原来的设置,在描述[2]提供了经验,为徕卡的发展做出了贡献新兴市场低温CLEM解决方案(图1)。这个解决方案可以执行低温CLEM在一个更可靠的和直观的方式。
为什么低温CLEM如此有用吗?
低温CLEM让我们确定有趣的生物对象(这可能是动态的,罕见的,或者很难找到),基于荧光信号。我们可以找到同一对象和获取高分辨率结构数据,在上下文中,通过低温新兴市场(图2)。在许多情况下,这些信息不能以任何其他方式获得的。
