图1:为了在没有机械切片的情况下研究哺乳动物大脑的深层结构，一种新方法使用电泳组织清除来减少光散射。未切片的Thy1-YFP小鼠脑组织经CLARITY处理后，用新的徕卡HC FLUOTAR L 25x/1.00 IMM马达VISIR物镜在徕卡微系统共聚焦系统上成像。188金宝搏的网址由美国加州帕洛阿尔托斯坦福大学Karl Deisserroth和Raju Tomer提供)。
插入物显示了海马体的三维多色图像。EYFP(绿色)，parvalbumin阳性神经元(红色)，GFAP(蓝色)。Macmillan Publishers Ltd: Nature 497: 332-37，版权2013。
中世纪对人体开腹的禁令——至少在小说中是这样——被超人的特殊能力——x光视力所绕过。尽管在这个问题上有一些科学的讨论[3]很明显，用可见光是看不到不透明物质的。在活体材料中观察组织，例如通过颅窗观察大脑，不能让我们看得太深，因为散射和吸收仍然发生在脑组织中。作为固定材料的一种选择，在显微镜的历史上已经提出了各种各样的“清除”方案。这些方案旨在减少散射和去除吸收物质。
结算方法
在显微制剂方案中，经典的“增白剂”是氢氧化钾和乳酸等化学物质，它们可以改变组织的化学性质。特别是含有几丁质的物体受益于这种处理。丁香油也被用于使组织透明，它很容易与加拿大香脂混溶，并具有相似的折射率(1.54)。除了漂白吸收分子，成像厚生物物体的主要问题是散射，散射发生在折射率变化的许多边界(图2b和c)，光必须通过这些边界传播。因此，清除方法的主要任务是在不破坏三维结构和不降解可能存在的荧光染料的情况下"均衡"折射率。
图2:a)吸收颜料后透明度低;b)在折射率变化的表面有效散射导致透明度低;c)折射率均衡后透明度高。
减少组织折射率变化的一种选择是除去水，用折射率更高的有机化合物代替。早在100年前，斯帕尔特霍尔兹就用苄醇和水杨酸甲酯描述了这种治疗方法[4]．他提出最终的安装溶液必须具有与干燥材料的平均折射率相同的折射率。从那时起，许多衍生程序已经出版，主要是不同的化学品应用(包括丁香油)。所有这些方案都有两个共同步骤:首先通过增加乙醇或四氢呋喃浓度的孵卵来“干燥”样品［5］然后用甘油、苄醇-苯甲酸苄酯(BABB)或二苄基醚(DBE)等高指数溶剂重新填充。免疫标记在处理后是不可能的，必须在清理前应用。荧光染料不是很稳定，应在清除后立即进行成像。对于大多数配方，样品在处理过程中通常会收缩，这表明三维结构的相干性可能会部分丧失。
类似的方法试图增加水相的折射率，通过添加水溶性化合物，如葡萄糖，果糖(种子b[6])或尿素(鳞片[7])．在这种情况下，样品不需要被干燥。音量变化取决于方法，可以是低(SeeDB)或大(Scale)。由于高渗透压，材料可以沿一个轴膨胀1.5倍或更多。仅仅是扩大可能就是提高透明度的一个重要贡献。为了从远处观察组织，扩大样品是适得其反的，因为物镜的自由工作距离是成像深度的限制。如果样品膨胀1.6倍，有效的最大成像深度减少38%。
减少折射率变化的第三种方法是用折射率更高的极性溶剂ClearT代替水(n = 1.33)[8]使用甲酰胺孵育(n = 1.45)。这一过程不会显著改变体积，并允许亲脂性示踪染料成像，因为该方案不使用破坏膜结构的洗涤剂。一种变体添加了聚乙二醇，它可以保护绿色荧光蛋白免于分解，因此在带有荧光蛋白标签的样品中产生更好的信号。
Pellucidation过程
斯帕尔特霍尔兹在他的书中使用了“das Durchsichtigmachen”这个词，即使对德国人来说也是一个奇怪的词。它比“清除”更具体，因为它的字面意思是“透明”，即“使透明”-当然不破坏空间结构。为了通过一种完全不同的方法来实现这一目标，Karl Deisseroth团队开始开发一种新的程序，在不破坏蛋白质组装的情况下，真正使大脑透明，并可以选择使用系列免疫染色来研究功能网络的分子排列。他们称他们的方法为CLARITY[9]．
如上所述，深层成像的麻烦制造者是脂质。大脑的膜体是由体细胞膜、轴突管和树突管、核膜、室室膜和突触结构组成的复杂而密集的堆积体。在顶部，这个集合被大量的囊泡冠状，它们是非常有效的散射体，在所有细胞中移动。所有这些膜的工作是保持结构完整，并将不同的隔室分开。只要加入清洁剂就能溶解膜状结构，把大脑变成接近原始汤的东西。
因此，CLARITY协议(图3)的第一步是将蛋白质固定在其3D坐标上，而不依赖于膜性结构。为此，整个(麻醉)动物被灌注一种用于产生水凝胶的单体，典型的是丙烯酰胺和交联剂(甲醛)。甲醛会与蛋白质和其他生物分子共价结合，这是它作为固定剂的经典功能。它还将水凝胶单体与生物分子交联，但不会与脂质交联。该溶液还含有热引发剂。在低温下充分灌注后，温度提高到37°C。添加的热引发剂开始聚合，生成水凝胶——就像任何丙烯酰胺凝胶一样。大多数蛋白质成为三维网格的一部分，因此被称为混合凝胶。这就是蛋白质如何被固定在它们的在活的有机体内的位置。
图3:a)有膜的生物组织(粗黑线)支持蛋白质的空间分布(彩色)。b)灌注聚合物组分后，蛋白质通过交联(蓝点)固定在水凝胶(细蓝线)上。c)去除膜后，组织是透明的，甚至可以渗透大分子，如抗体和荧光色素。蛋白质和其他生物分子被固定在它们的体内坐标上。
第二步，用SDS溶液培养大脑。洗涤剂会溶解膜并形成胶束。水凝胶，包括结合的生物分子，不受影响。为了加快这一清除过程，胶束的去除被电泳加速，因此这一过程被称为电泳组织清除(ETC)——脂质被电吸出大脑。剩下的结构是一种无膜的水凝胶，其中含有大部分蛋白质在它们原来的位置。光学性质完全改变了:水凝胶是高度透明的(软性隐形眼镜是由水凝胶制成的)，而且整个大脑的折射率相当均匀。188金宝搏的网址因此，散射接近于零，组织是透明的。
整个过程对荧光蛋白非常友好。如果动物含有一种或一系列荧光蛋白，清除后的组织将在原始位置呈现这些蛋白质，荧光不淬灭(这是BABB制备中的一个问题，在Scale方案中也有部分问题)。样品不仅是透明的，而且允许大分子扩散到深层。用一组不同颜色的荧光染料对整个大脑进行连续免疫标记。这是大脑结构图绘制项目和类似研究任务的关键。亲脂性示踪染料，如DiI，当然不能与无脂样品一起工作(除非使用可以与水凝胶交联的染料)。
合适的光学
用CLARITY方法制备的样品可以用所有的荧光技术成像，最好是用共聚焦显微镜，它提供所需的高轴向分辨率。镜片应该有足够长的工作距离，以便在不进行机械切割的情况下通过大脑聚焦。对于大脑绘图，视场应该很大，以便在尽可能少的瓷砖中水平记录完整的大脑。所要求的空间分辨率将要求高数值孔径，多通道多光子成像将需要在从蓝色到近蓝色的光谱范围内具有高性能红外．即使在几毫米的深度，也要正确地设置所有这些参数，关键是控制光程长度，即在透镜上安装一个校正环，使其能够适应不同的折射率。
徕卡正在发布这样一款镜头:HC flutar L 25x/1.00 IMM (ne= 1.457)马达VISIR。这款镜头在25倍放大倍率下提供22毫米的视场，即近1 × 1毫米的视场。蓝绿光的横向分辨率约为250 nm，自由工作距离为6 mm。当转动一次时，这足以对12毫米厚度的物体进行取样。该透镜具有470 nm到1200 nm的高透过率，它是为折射率在1.45左右的样品设计的。校正领是电动和软件控制，这允许自动校正，同时聚焦到样品的不同位置。
参考文献
- 维萨里:Libri - vii(1543)。
- Levasseur JE等:中风6:308-17(1975)。
- Pittenger JB:知觉12(5):635-39(1983)。
- 斯帕尔特霍尔兹:Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten, 2。Aufl。S. Hierzel Verlag，莱比锡(1914)。
- Becker K等人:PLoS ONE 7(3)(2012)。
- Meng-Tsen K等:神经科学学报，16:1154-61(2013)。
- Hama H et al.: Nat. Neurosci. 14(11): 1481-88(2011)。
- Kuwajima T et al.: Development 140: 1364-68(2013)。
- Chung K等人:自然497:332-7(2013)。
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本文发表于《成像与显微镜》01/14，可从以下地址获取PDF下载．
