2019年10月17日, 摘要

SP8 FALCON:荧光寿命成像的新概念，支持视频速率共焦FLIM

SP8 FALCON (FAst寿命对比度)是一种快速和完全集成的荧光寿命成像显微镜(这部电影)共焦平台。SP8 FALCON提供视频速率这部电影通过像素-像素量化，这要感谢一种基于快速电子和灵敏光谱混合探测器的测量荧光寿命的新概念。光子到达时间以标准共聚焦成像的典型计数率记录。该系统具有超短的死机时间和强大的内置算法，用于数据采集和分析。深度整合这部电影进入共焦平台提供了方便的复杂访问这部电影实验。

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定量成像

共聚焦成像是目前生命科学中荧光成像的标准。功能成像超越了传统的分子物种位置和浓度的记录，可以进一步研究分子功能:它们与其他生物分子的相互作用，以及它们的活性、构象、分子环境和翻译后修饰。理想情况下，这必须在高时空分辨率下完成。荧光寿命非常适合于报道生物分子的功能状态，因为分子处于激发态的时间高度依赖于它所处的环境以及与附近其他物种的相互作用[1,2]。由于寿命信息与荧光团浓度无关，它是功能成像的首选方法。然而，有几个因素限制了……的广泛应用这部电影．首先，传统的时间相关单光子计数(TCSPC)解决方案本质上是缓慢和难以实现的，特别是对于复杂的成像工作流程。因此,这部电影到目前为止，成像仅限于专业实验室，即使有专家知识，传统的TCSPC也无法提供在几十秒以下时间尺度发生的生物过程的速度。

图1:徕卡SP8 FALCON相机内部。a:来自脉冲激光激发和发射光子的模拟信号被记录，用单独的比较器进行数字化，并输入到10-GHz采样器。对产生的比特流的模式识别分析将其转换为光子到达时间(Fast这部电影)．结果显示为Fast这部电影、荧光强度图像、整体衰减曲线和拟合寿命值。示例图像分别是用α-微管蛋白(AF546)和波形蛋白(AF555)免疫染色的U2OS细胞。色条，0 - 3ns。比例尺，5 μm。b:该系统可以将多个探测器检测到的光子合并为一个，以更高的光子通量工作。

为了克服速度和实验复杂性方面的限制，我们开发了一种测量寿命的创新概念(图1a)。的这部电影SP8 FALCON上的方法基于共聚焦扫描头，带有现场可编程门阵列(FPGA)电子学、脉冲激光激发和快速光谱单光子计数探测器。来自每个探测器的激光脉冲和光子到达脉冲信号都以97 ps的时间分辨率高速数字化，数据流作为位流由fpga控制的模式识别算法进行分析。这一步通过探测脉冲和激光脉冲到达时间的差值来确定光子到达时间。通过测量激光脉冲到探测器脉冲的时间差来避免抖动伪影。这些步骤直接在系统电子设备上执行，确保最大速度和保持信号质量。然后将数据传输到计算机生成图像，根据光子总到达时间建立衰减曲线，并计算荧光寿命。这些来自检测脉冲和激发脉冲到达时间差异的直接测量直接在线呈现为“Fast”这部电影的图像。
传统TCSPC的速度限制来自长电子和/或探测器死时间，使系统无法跟上典型的现代共聚焦体制的光子通量。为了避免由于所谓的叠加效应而低估寿命[4,5]，传统的TCSPC系统在每个激光脉冲的光子通量介于0.01到0.1光子之间[5,6]运行，测量误差约为2.5%[7]。纠正堆积效应的努力已经在之前描述过[4,8 - 12]。

SP8 FALCON实现了两种互补的方法，可在高光子通量下实现终生捕获。第一种方法是将多个探测器合并并视为一个探测器(图1b)。这要归功于SP8平台和SP8 FALCON电子产品的全光谱灵活性。光谱的灵活性使探测器的范围可以自由调整，以覆盖单个发射光谱，电子设备处理来自多个探测器的信息，就像它来自单个探测器一样。探测器的增加增加了光子通量，这可以在采集之前或在分析步骤设置。事实上，SP8 FALCON保留了单个探测器比特流的信息，因此它们可以在任何时候一起或单独分析。这种多探测器方法，加上整个系统死区时间低于1.5纳秒，可以实现精确这部电影以每脉冲1光子的速率进行测量(图2e，详见下文;当使用80mhz脉冲激光器时，每个探测器可以达到80 Mcps)。第二种方法是实现高速这部电影光子滤波器，避免堆积效应。该滤波器确保了在高光子通量下的整体寿命衰减的忠实表示。

图2:SP8 FALCON的寿命测量精度。a、SP8 FALCON的原理图这部电影形式。b，不同光子滤波器对寿命衰减的堆积和死时效应。c, U2OS细胞中的Flipper-TR®。色条，2-4纳斯;比例尺，10 μm。整体衰减与基于像素的衰减曲线。d，转染EPAC的HeLa细胞中的cAMP信号转导这部电影-烦恼生物传感器。这部电影三种光子模式在高光子通量下的数据质量。色条，2.5-3.7纳司。比例尺，30 μm。e，随着光子通量的增加，罗丹明B寿命测量(参考值为1.47 ns)(以每秒兆数为单位，Mcps)。红色方块:高速的结果这部电影过滤器。蓝色三角形:第一个光子滤波器的结果(经典的TCSPC行为;打开)。灰色钻石:未经过滤的结果。灰色框表示2.5%的误差区域。开放符号，单检测器结果;用两个成对的检测器填充符号。

除了高速这部电影滤波器，我们实现了两个附加模式来评估数据的质量(图2):“第一光子”滤波器和“所有光子”模式。“第一光子”滤波器(图2a)完全从每个脉冲后检测到的第一光子构建荧光衰减。该滤波器模拟了传统的TCSPC及其固有的堆积效应(图2b)，从而低估了寿命值。在较高的计数率下，所测寿命人为地降低了[2](图2e)。“所有光子”模式(图2a)使用检测到的所有光子构建荧光衰减。尽管这个选项有显著增加光子统计量的优势，但它也引入了一些偏差，如果不加以纠正，它可能会导致错误的生命周期(图2e)。尽管如此，“全光子”方法产生的测量寿命与传统的TCSPC相比误差更小。
使用高速这部电影滤波器(图2a)，我们实现了高光子统计和精确的寿命值，同时以最小的误差(图2e)。有了这个滤波器，我们确保脉冲之间只有单光子事件被用于构建和拟合整体衰减。然后，SP8 FALCON电子设备和新颖的架构允许我们直接使用这个整体模型和方程(等于。1)来自Patting等。[12]逐像素这部电影形象健康。这将导致:

其中，荧光衰减f(t)用模型函数进行校正;IRF为仪器响应函数;Ai，寿命分量的振幅;B,背景;P，激光脉冲数;τ,一生;td，死亡时间。

从高速得到精确的整体衰减曲线后这部电影滤波器，我们可以应用合适的数学模型逐像素计算。在每一个像素点，我们使用未经过滤的数据建立衰减和整体数学模型进行拟合。

患者源性类器官的实时3D FLIM。 — 图3:实时3D这部电影在patient-derived瀑样。监测癌衍生的信号转导活性的活类器官与ERK烦恼-这部电影biosensor14(右)。对应的荧光强度图像，无功能信息。功能信息显示烦恼ERK生物传感器的效率。更高的烦恼效率表明ERK活性较高。彩条2 - 12%烦恼效率。比例尺，20 μm。

通过这种对偶方法，我们确保使用了最好的拟合模型，以及适当的光子统计(图2c)。这对于具有非常不同光子状态的子区域的样品尤其有用。为了说明这一点，我们对表达非常可变的EPAC cAMP的HeLa细胞进行了成像这部电影sensor13(图2 d)。所有细胞都具有相同的cAMP水平，对应的测量寿命为~3.5 ns(图2d中的黄色像素)。“第一光子”和“所有光子”滤波器在高光子通量的视寿命中显示出严重的错误。高速这部电影滤波器捕捉所有光子通量的精确寿命值，每脉冲可达2.5光子。
为了量化每个滤波器的影响，我们在增加激光功率的情况下，使用罗丹明B溶液进行了寿命测量，每次衰减至少有100万次(图2e)。我们最初用每个脉冲0.01个光子进行测量，并将其设置为参考寿命值。这些测量使我们可以直接看到增加计数率对寿命确定精度的影响。我们注意到，使用“第一光子”滤波器，堆积效应在20-40 Mcps时已经成为一个重要问题。当使用“所有光子”方法时，测量的寿命更接近参考值，但仍然产生较低的值。标准的高速这部电影SP8 FALCON上的滤波器(图2e中红色方块)允许在高达225 Mcps的光子状态下一致地测定罗丹明B寿命，误差在0.2%到1.6%之间。数据显示，SP8 FALCON明显增加
可用于可靠寿命测量的光子通量制度。
高速这部电影SP8 FALCON的记录对于苛刻的生物实验来说是一项至关重要的资产。例如，它使ERK活性的时间间隔记录成为可能14(图3)。ERK信号是结肠直肠癌和其他几种癌症中恶性细胞生长的重要驱动因素，使用改良版的EKAREV生物传感器记录了该信号15。

总之，ew发现的共聚焦和多光子功能成像的速度性能，以及生命周期成像与所有基于强度的共聚焦成像和处理工具的无缝集成，使研究生物过程在以前无法达到的时间尺度上成为可能。