2013年11月04 故事

超分辨率显微镜与三维

光学成像设备具有有限的景深和衍射极限分辨率。景深问题首先用共焦显微镜解决；衍射极限分辨率在超分辨率显微镜中已经存在了几年。解决景深问题的超分辨率显微镜现在已经在实验室中使用定位超分辨率使用基于像散的z编码。发生的超级分辨率采用混合相位面罩概念，用于横向和轴向尺寸的可调谐超分辨率。

作者

罗尔夫T. Borlinghaus，博士

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主题和标签

超级分辨率

光学切片

视觉通常被认为是我们感官中最令人印象深刻的。为了保存视觉印象，或者增强视觉印象以增加乐趣，人们做了很多尝试。光学成像设备有一个恼人的缺点，但是:清晰成像的范围是有限的。这个有限的范围被称为“景深”。尽管我们的眼睛也有同样的局限，但我们的大脑有办法巧妙地将整个图像中最清晰的部分过滤到我们的意识中。如果我们看一张照片，想知道为什么有不清晰的区域，我们就会意识到这是欺诈。

在光学显微镜中，景深相对较浅，特别是当我们以高分辨率记录图像时。一直以来都有人试图增加景深——或者消除不锐化的影响。

过去，通过将样品切成比景深更薄的薄片来解决这个问题。这些样本没有显示任何失焦贡献。但它们也缺乏人们试图理解的对象的结构完整性。要重建物体的三维视图，例如细胞或小生物体，必须切割一大系列薄片，然后合并记录的图像。这一过程显然相当繁琐，切割通常会导致严重变形，阻碍正确的重建。

一个更好的方法是所谓的“共聚焦显微术”［１］).共聚焦显微镜通过光学布置去除任何不属于景深的任何贡献，该光学布置是“检测针孔”。为了生成三维重建，它足以将焦点位置大约一半的焦点，并通过适当的软件合并记录的图像。在过去的20年中，这种方法已成为生物医学成像的标准程序188bet怎么注册[2]．

第二种具有相同目的的方法是多光子显微镜[3]).这里，光学切片是通过一种非线性效应发生的，它只激发薄层中的荧光分子。

真共聚焦扫描显微镜(TCS)的光束路径。探测针孔就像一个空间滤光片，只让来自焦平面的光通过。实现，例如在徕卡TCS SP8系统。 — 图1：共焦扫描显微镜的光路。尽管光从所有层沿z方向辐射，但只有一个焦平面传输到探测器。焦平面上方和下方的光通过针孔有效地去除，针孔起到空间滤波器的作用。OL，物镜；BS，分束器；PH，针孔。

更好的z分辨率：4PI

传统显微镜的一个自然局限性是样品的光只能从一侧收集。从单个点出发，只有半个球面可以重建图像。这个半圆对应的实心角为2p。如果可以在标本的两侧使用两个相对的透镜，那么理论上可覆盖的实心角度应该是4p，这就是4PI显微镜[4]. 在实践中，单个透镜可以覆盖的最大值约为1.3 p，而4PI显微镜实际上是一个2.5 p的显微镜。在4PI显微镜中，样品必须夹在两个盖玻片之间，并且必须足够薄，以便留出聚焦空间。因此，厚度大于50µm的样品通常不适用于4PI显微镜。两侧的相干照明产生了一个有限的强度层，可在轴向上实现约100 nm的分辨率。与经典共焦显微镜的轴向分辨率相比，该分辨率提高了5-10倍。虽然术语4PI显微镜表明分辨率加倍，但横向性能并不明显优于共焦显微镜。这类仪器是第一台商用显微镜，它改进了聚焦光成像（徕卡）TCS4PI[5]).

无限的决议：被删除

光靠光学方法显然不能显著提高分辨率。“非凡的”是指某物不仅提高了几个百分点，而且至少提高了两倍或更好。第一个概念是由Stefan Hell在1994年提出的[6]．这个概念包括非光学物理现象，这是与早期尝试的关键区别。这里所采用的现象是“受激辐射”，最初由爱因斯坦在理论上描述［7］并在激光光源中得到实际应用。的发生的概念利用刺激的发射在发射之前部分消耗激发荧光状态。这对应于在激发点扩展功能的区域中切断振兴状态。如果可以仅在衍射限制激励点的边界处设法耗尽，则剩余发射区域将较小，因此改善了分辨率。幸运的是，只有相对简单的手段，仅照亮斑点衍射图案的边界：甜甜圈形焦点。通过将适当的相板插入照射光束路径来产生这种焦点。然后，照明是双倍的：首先通过适当的荧光激发波长，然后具有普通的圆形“通气聚焦”，然后，通过甜甜圈形状的“耗尽焦点”具有适当的波长。然后在任何其他扫描光学显微镜中收集发射。发生的因此，显微镜很容易从共焦激光扫描显微镜中衍生出来。第一个商用系统规定分辨率低至80 nm(徕卡塔塔、) 2007年［8］．

一种不同的方法:GSD

一次发生的超分辨率已经证明了它的能力，可以让图像具有比纯光学(衍射限制)成像更好的分辨率，咒语已经被打破，讨论超出衍射限制的分辨率是安全的。第二个突出的方法是随机的。在荧光发生器被充分稀释以确保观测到的光点仅来自单个发射器的约束下，可以假设光点代表点扩散函数。然后，找到点扩展函数的中心是一个简单的任务，这允许发射器以非常高的精度定位。为了重建完整的图像，需要记录大量的图像序列，每个图像只包含几个分离的发射器，从而得到研究中的结构的相干图像。这里再次需要一个切换器，以确保每个图像的发射器足够稀疏，并为后续图像恢复无声发射器，这是必要的，以覆盖整个结构。早期的建议是使用可切换荧光蛋白来完成这项任务［9］．然而，几乎所有的荧光色素都能发挥从兴奋态到暗态的切换行为。最著名的暗态是三态，这是由荧光色素随机假定的。在适当的光照强度下，大多数荧光分子可以保持在黑暗状态，只有偶尔有一个分子处于短时间的兴奋状态。在此期间，psf被记录，并为后续的超分辨定位做好准备。这种方法被称为基态耗尽显微术[10,11]．2011年推出了一个基于这一概念的商业系统，徕卡SR GSD [12]．

本地化第三维度

定位显微镜提供了改进的横向分辨率。理论上，也可以沿z轴定位所有点的最大强度，但这需要非常长的采集时间。此外，定位显微镜通常基于Tirf.技术，不用于聚焦到样品中。然而，覆盖的范围Tirf.约为300 nm，能够在此范围内测量发射器的位置将是有趣的。为了完成这项任务，光学像差变成了优势:散光。透镜在未聚焦时倾向于产生杆状的光斑源结构。即使在焦平面上正确地重建了光斑，人们也可以探测到焦平面上下的铅笔状结构。有趣的是，这些铅笔会随着z轴旋转。在z-分辨定位显微镜中，通过插入柱面透镜故意引入散光[13]．然后测量每个定位点的旋转角度，最后给出z轴上约50 nm的精度。该方法适用于任何类型的定位，因此也与上述基态耗尽技术相结合。该文书的商业版本最近已推出(徕卡SR GSD 3D [14]．

所有尺寸的无限分辨率：STED 3D

最终目标是横向和轴向的无限制分辨率，而不受场大小和自由工作距离的限制。这个发生的这种方法可以自由聚焦到样品中——至少在理论上是这样。有限轴向分辨率的障碍可以通过特殊的相位掩模来克服，这种相位掩模消耗了点扩散函数前后端的激励。不幸的是，这种相位掩模的设计不允许横向零，simult同时，为了得到横向和轴向同构的点扩展函数（本质上是球体）发生的该技术与4PI技术相结合[15]．虽然这种方法很好，但繁琐的4PI显微镜与另一种非琐碎技术结合尚未准备好作为生物医学实验室的日常工具。188bet怎么注册甚至受过良好受过良好教育和培训的成像设施会质疑此类设备的最终利益。更简单的解决方案是将横向和轴向模式结合在3D中发生的显微镜。在这里，耗尽光束首先由一个可调谐分裂装置分裂。一条腿配备了涡旋相位掩模(这是提高横向分辨率的最佳设计)。另一条腿配备了相位掩模，这是提高轴向分辨率的理想选择，称为“z-甜甜圈”。两条腿的重组创建了一个点扩展函数，其形状接近一个空心球体(想象一个果冻甜甜圈)。这个空心球将消除围绕在激发点扩散函数中心的各个方向的激发态。由于横向和轴向损耗的比例是可调的，可以优化设置，以实现同构分辨率、最小的检测体积或最大横向和轴向分辨率。这项技术现在已经商业化(徕卡TCSSP8.发生的3x.［16］)标题图片显示了共焦显微镜（左）和3D的比较发生的（对）。组蛋白染色于HeLa细胞的细胞核中。水平部分（上部）中的虚线表示轮廓部分的位置，其显示在下部。注意横向和轴向方向的显着提高的分辨率与3D发生的．

Leica TCS SP8 SP8 SP8的光束路径3x照明模块。耗尽激光能量被分成两个级分，可以通过可调谐分离器调节比率。由此产生的耗尽束可调谐横向和轴向DI的分辨率改进 — 图2:光束路径发生的3x照明模块。耗尽激光能量被分成两个级分，该比率可以通过可调谐分离器（Vs）调节。一臂包含相位掩模（φxy），其被设计用于衍射无限的横向分辨率。另一臂配备有不同的相位掩模（φZ），其允许轴向上的超分辨率。两个照明模式都在合并（M）中组合。所得到的耗尽束可调谐横向和轴向的分辨率改善。

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