FIT RNA探针

RNA是什么?

缩写RNA代表核糖核酸。这些分子几乎对生命的所有过程都是不可或缺的，因为它们介导了基因表达的所有步骤:信使RNA (mRNA)从基因转录出来，将信息带出细胞核。在真核生物的转录过程中，mrna成熟，这涉及到插入序列(内含子)的去除。这个被称为剪接的过程主要是由包含剪接体的sn/U RNA介导的。大多数mrna从细胞核输出后，会被含有核糖体的rRNA翻译——这些编码是通过携带活性氨基酸的转移rna来解释的，用于合成蛋白质。特定mrna的翻译和寿命部分受短rna - microrna、短干扰rna和pirna的控制。不仅是上述的RNA物种，实际上基因组的很大一部分都被转录了——这方面的意义目前正在积极研究。

近30年前，β-actin mRNA分子被发现不均匀地定位于鸡成肌细胞和成纤维细胞的细胞质中。很快，在其他模型系统中，许多其他的例子也接踵而至，例如在出芽的酵母、果蝇、非洲爪蟾的卵母细胞以及哺乳动物的成纤维细胞和神经元中。最近，对果蝇胚胎和卵母细胞RNA定位的全基因组研究表明，大部分(高达80%)表达的转录本以一种独特的、非同质的模式分布在细胞质中。此外，尽管细菌很小，没有明确的细胞器，但它被证明能表达局部的mRNA。

大约十年前，由于引入了单分子灵敏度显微镜技术，通过计算RNA分子，以前所未有的细胞或亚细胞分辨率测量绝对RNA数量成为可能。这些技术目前正处于允许在显微镜下对单个细胞进行“深层转录组测序”的边缘。

当然，显微镜不仅提供了RNA分子的快照（位置和数量），而且通过适当的成像方法，揭示了转录、RNA定位、翻译和衰变的深刻机制。

RNA类似于DNA和多肽，是一种高分子聚合物。它的身份是由一级结构或构建块的顺序决定的，核糖核苷酸(A, C，大多数RNA分子是单链的——尽管它们折叠成复杂的二级和三级结构，通常涉及分子内双链的形成——因此它们的身份可以通过匹配的互补序列来探测。这些探针大多是天然的单链核酸(ssDNA或RNA)，带有一些可检测的标签，包括放射性同位素、免疫可检测的小分子半抗原或荧光染料。在称为原位杂交的过程中(伊什)，探针找到并结合它的目标RNA。一个无错配的杂化物通常在能量上比其他由探针形成的特定复合物更稳定，因此通过包括适当的洗涤步骤伊什协议一个特定的信号被开发。然而，由于这些强制性的分化步骤，除了严酷的治疗之外，有些伊什协议要求(使用高温，有机溶剂，高盐等)-没有这些伊什技术与生命细胞成像兼容。

RNA从不“裸”存在于细胞中——它总是与一组形成核糖核蛋白颗粒(RNPs)的动态蛋白质分子复杂在一起。许多这些蛋白质分子直接结合RNA (rbp)。将这些rbp与荧光蛋白(FPs)融合是一种广泛应用的RNA活体可视化方法。大多数在真核细胞库中发现的rbp，如Staufen, eIF4AIII, Hrp48A, PABP等，都具有有限的靶向特异性，并且只是特定RNP的部分宿主。然而，一些rbp，如Pumillio Homology Domain (pumi - hd)或CRISPR/Cas9，可以被设计成匹配给定的RNA靶标。然而，为了有效地可视化mrnp(通常包含一个mRNA分子)，每个粒子需要多个RBP-FP融合副本。为了减少每个目标分子的转基因结构，最常用的活体RNA可视化技术是利用与宿主同源的rbp。第一个是MS2系统，由6-24个MS2噬菌体特有的RNA茎环结构串联阵列和与FP融合的MS2外壳蛋白组成。通过将MS2环状阵列引入目标Ash1 mRNA，并将未结合的MCP-FP隔离到细胞核，Singer实验室可以在活芽酵母中动态成像Ash1 mRNA。

这些phage-loop /循环绑定的一个共同缺点外衣蛋白质系统是他们依赖RNA的转基因修改目标——主要是引入一个额外的副本除了从内部存在两个等位基因,数组循环加载的外壳蛋白增加约1.5 - 2 MDa RNP感兴趣的的大小。这些变化可能会影响靶标rbp的动力学(转录、转运、翻译和衰变)，因此，理想情况下，获得的结果应该用其他独立、互补的方法进行验证。

1996年，Tyagi实验室推出了分子信标(MBs)，开创了荧光探针的使用。MBs是短的寡核苷酸探针，在其两端有一个荧光团和一对猝灭剂。这些末端(通常是6-7个核苷酸)相互补充，形成发夹结构，从而将荧光团定位在猝灭剂(暗态)旁边。在MB的目标特定的中间部分(环)杂交后，发夹的茎被熔化，分离荧光团和猝灭剂，导致荧光(亮态)的激活。MBs的使用(通常是荧光探针)不需要区分洗涤步骤，也不需要对靶标进行转基因修饰。

不幸的是，无论是RNA/DNA杂交还是双链RNA都不是稳定的在活的有机体内．为了解决这个问题，这些探针的主干被化学修饰，以隐藏形成的杂交不被胞内核酸酶。作为一个积极的副作用，这些修饰——主要是磷酸核糖骨干的2'O甲基化和/或锁定核酸的结合——增加了杂交的稳定性，允许更短的探针。

FIT代表什么？

噻唑橙（FIT）的强制插层是获得荧光探针的另一种方法。Seitz实验室开发的这些探针包括一种插入式DNA染料，噻唑橙（TO）作为碱基替代物，取代寡核苷酸序列中的非末端碱基。这种染料在低粘度环境中，如溶液中（暗状态），是非荧光的。探针杂交后，探针两侧碱基对的氢键将极大地限制染料的扭转运动，从而迫使其进入插层状状态，激活荧光（明亮状态）。因此，与MBs不同，FIT探头对不匹配非常敏感，尤其是对to附近的探头。

荧光报告的一个最重要的特性是亮度。量子产额的发射在很大程度上取决于其所处的微环境;不仅对探针的杂化状态有影响，而且对TO核苷的位置和邻近区域也有影响。在明亮状态下，与互补ssDNA分子杂交的FIT探针的典型亮度约为7-14 ml⋅mol¹⋅厘米¹约为EGFP的20 - 40%，AlexaFluor 488的10 - 20%。然而，成像的另一个关键参数是对比度，即信号与其直接背景的比率。传统的荧光体，如EGFP或AlexaFluor 488，在不与靶标或溶液结合的情况下，同样明亮，而to标记的FIT探针的暗状态比其亮状态(响应性)暗8 - 20倍。这一特性使FIT探针适合于进行快速无洗涤荧光原位杂交(鱼)，甚至在其他具有挑战性的组织中，例如果蝇卵巢。

并非如此——因为这些探针很短，通常15-30个核苷酸长(5-10纳米)，两个或更多的荧光团被定位在Förster共振能量转移范围内(烦恼)因此，相互熄灭，亮度仅增加20–40%。然而，我们设法将亮度提高了一倍（约为24-28毫升）⋅ 摩尔¹⋅厘米¹)，将微红移且更亮的荧光团恶唑啉吡啶(JO)引入到含有TO的FIT探针中。JO作为插层染料，即使在溶液中也相当明亮;它的反应性很低。然而，在单链探针中，TO通过碰撞有效地熄灭JO。杂化导致亮态。由于成形双相的刚性，to不再淬火JO。相反，激发能是通过烦恼从TO到JO，恢复JO的最大亮度。

增加单个FIT探针亮度的另一个选择是增加to所经历的局部约束。我们证明了引入一个锁定的核酸(LNA) 3 ' TO使给定探针的最大亮度加倍，同时保持响应性有效不变。这一效应是由于在双相增加的局部黏度中，lna诱导相邻碱基之间的堆积距离减小。

几乎-探针主链中的一个LNA修饰并不能提供足够的核酸酶抗性来形成双链，然而，随着核糖的2 ' OH的额外甲基化(混合设计)，探针在注射后一个多小时内保持稳定果蝇卵母细胞。而且，单个探针很少有足够的亮度来揭示单个RNPs。通过结合三到五个不同的混合探针奥斯卡我们设法获得了类似于10x MS2标记转基因的亮度和对比度奥斯卡用MCP-EGFP标记的rnp。

图4:体内RNA成像:靶向三种混合剂FIT探针的混合物奥斯卡mRNA被注射到活的野生型卵母细胞(G，用箭头标记)中。奥斯卡注射后50分钟仍可观察RNP运动(H，箭头)。比例尺分别代表G和H中的50微米和5微米。资料来源:Hövelmann和Gaspar等人，2014年。

我们使用了上述方法oskarMS2(10倍)/MCP-EGFP系统，由我们和其他公司存档，作为参考。即使同时注入所有五种混合器探针，我们也没有观察到差异奥斯卡RNP运动比较oskarMS2. 当这种独立的分析不可用时，一个好的做法是测试几种不同FIT探针的不同组合。

当然，并不是所有的探测器都是惰性的。通过锁定一个已知的重要的双链二级结构奥斯卡mRNA定位(一个所谓的定位元件)，用一个与其中一条链互补的混合探针(osk6)，我们诱导了同样的缺陷奥斯卡RNP运动如先前报道的一系列突变奥斯卡转基因产品。基于FIT探针的操作不仅比生成和分析转基因RNA副本花费的时间少得多，而且只对RNP生物发生的一个特定步骤——在本例中是运输。另一方面，突变可能会从转录开始影响mRNA的命运，因此，观察到的表型可能是由于一系列缺陷的总和。

总之，仔细选择FIT探针不仅是RNA可视化的工具，也是RNP功能发现的工具。

是的,你可以。因为大多数模式生物现在有大量的(E)库绿色荧光蛋白对于标记的融合蛋白，找到EGFP和to这两个荧光团在何种条件下可以共同可视化是至关重要的。与EGFP相比，TO的吸收和发射光谱有足够的红移，仔细选择激发光(EGFP为470 nm, TO为525 nm)，在顺序扫描中，两个分子之间几乎没有交叉。这些激发波长可能看起来有点奇怪——事实上，对于这种双色成像，我们使用了最先进的徕卡共聚焦显微镜，配备了超连续光源。当然，我们首先使用的是oskarMS2(10倍)/MCP-EGFP系统结合FIT探针检测两种信号的共标记和共迁移。

然而，更有趣的应用是测试在RNP生物发生过程中可能具有功能的蛋白质的共定位。传统上，这样的发现是在在质量生化分析。然而，显微镜与此类分析相比具有明显的优势：它可以定义所讨论的相互作用的地点、时间和动力学。不幸的是，RNP通常小于衍射极限，并且只包含一个给定RBP的少数副本（可能只有一个副本）。因此，由于大多数免疫染色不可避免地会导致点样特异性标记——即使带有特异性抗体——真实RNP与特异性背景无法区分。另一方面，EGFP融合蛋白的自体荧光具有几乎百分之百的特异性，并且只有一种单一的特异性绿色荧光蛋白分子可以用当今最灵敏的探测器探测到。

事实上——主要不是因为RNP的大小，而是因为它们在某些位置可以达到的拥挤程度。自果蝇卵室是一个相当厚的样本（沿轴向约100微米），有趣的部分由10–15微米厚的细胞层从玻璃表面分离，这限制了方法的选择。我们发现发生的显微镜在这些条件下工作。LNA修饰的FIT探针已经被证明是非常优秀的发生的标签，因为在杂交后，不仅它们的亮度，而且荧光寿命也大大增加，因此门控发生的进一步提高所检测信号的靶特异性。此外，由于EGFP和TO的发射光谱重叠，单个592 nm耗尽激光足以实现双色发生的成像。尽管样品的光散射限制最大横向分辨率约80-120 nm，单个RNP和RNP子结构的分辨率都比传统共聚焦显微镜更详细。这样的成像使我们能够进行精确的基于目标的共定位分析。

近年来对不同的RNA成像方法进行了综述

• 加斯帕一世和以弗西一世:数量优势:定量单分子RNA检测方法。威利Interdiscip。中国生物医学工程学报(英文版);doi: 10.1002 / wdev.170。1月21日。

安装探头：

• Köhler O、Jarikote DV和Seitz O：强制插层探针(FIT探针):噻唑橙作为多肽核酸中的荧光碱基，用于同质单核苷酸多态性检测。生物化学。6(1):69-77(2005)。
• Hövelmann F，加斯帕一世，Ephrussi A, Seitz O:亮度增强的DNA-FIT探针，用于组织中的免清洗RNA成像。杰姆。化学。Soc。18; 135 (50): 19025–32 (2013); 内政部：10.1021/ja410674h。Epub 2013年12月10日。
• Hövelmann F、Gaspar I、Loibl S、Ermilov EA、Röder B、Wengel J、Ephrussi A和Seitz O：通过局部约束的亮度——lna增强的FIT杂交探针用于体内核糖核酸粒子跟踪。Angew。化学。Int。艾德。拉米夫。13;53 (42): 11370-5 (2014);doi: 10.1002 / anie.201406022。2014年8月28日。
• Kummer S, Knoll A, Socher E, Bethge L, Herrmann A, Seitz O:PNA fit探针用于H1N1流感感染活细胞中两个病毒mRNA靶点的双色成像。Bioconjug。化学17;23日(10):2051 - 60 (2012);doi: 10.1021 / bc300249f。2012年9月14日。
• Hövelmann F, Gaspar I, Kasper M, Chamiolo J, Steffen J, Ephrussi A, Seitz O:用于多色RNA成像的lna增强DNA fit探针。化学。科学。doi: 10.1039 / C5SC03053。2015年11月02日。