低温电子显微镜对纤毛和鞭毛的新认识

低温电子显微镜（cryo-em.）允许用于生物样品尽可能接近天然状态尽可能的高分辨率结构的观察。相对于传统的em.方法没有化学固定剂，如戊二醛或四氧化锇，或对比增强重金属的污渍，如乙酸双氧铀，被使用。这最大限度地减少固定和染色文物的风险。相反，将样品快速冷冻并同时在温度低于-160被不断地冷却直接在电子显微镜观察°C.对于小样本——蛋白质复合物、脂质体(见图1)、病毒、原核细胞、细胞器——浸泡冷冻(“浸入冷冻”)是样品制备方法的选择[1]．使用网格，柱塞这类徕卡EM GP，即典型地是20至500纳米厚的制备和迅速冷却的致冷剂例如在刚刚冷冻剂的熔点以上的温度下冷冻乙烷为了样品的薄膜来实现样品玻璃化［2］．较大的样品（最常见的，真核细胞和组织）对于暴跌来说太厚，可以使用高压冷冻，然后用冷冻切片制备。

一个研究领域的一个例子已经特别是从cryo-增加的分辨率受益em.是研究纤毛和鞭毛的学科。在真核生物中，纤毛和鞭毛是高度保守的、普遍的运动性和感觉细胞器，执行许多基本任务。人类的纤毛缺陷引起各种病症和疾病，统称纤毛病。将结构与功能联系起来，对于理解纤毛如何工作以及为什么它们在疾病中失败是至关重要的。样品的制备是先用低温浸入冷冻，然后再用低温电子断层扫描(cryo- et)——一种三维低温(3D)em.——其次是图像处理(subtomogram平均)的技术已经被证明是一个非常成功的策略来获得前所未有的见解纤毛和鞭毛的三维结构和功能(图2和3)。介绍了Cryo-ET纤毛的研究仅在2006年,不仅提供了更高的分辨率,本地的状态,3D结构，也极大地改变了我们对纤毛功能的理解以及疾病中哪里出了问题。与几年前相比，我们现在知道微管不是空心的空管，而是含有微管内部蛋白质(MIPs)［４］）;nexin连接在几十年前就被发现了，现在已经被确定为动力蛋白调节复合物的一部分［5］；径向辐条有微小的结构和可能的功能差异(6、7)我们有我们的第一次瞥见探讨如何在数以万计的动力蛋白分子与协调，以产生纤毛运动[8]．随着这些突破，许多新的问题被提出，并仍在等待回答。

提高了低温处理的分辨率和质量em.这是有代价的:已知的问题包括辐射敏感性(由于缺乏化学固定剂)和低对比度、噪声图像(由于缺乏重金属对比剂导致低信噪比)。这些挑战通常可以通过在低剂量模式下操作显微镜来尽量减少样品的辐射暴露，并使用图像处理(平均)来结合来自许多图像的信息来提高信噪比并最终提高分辨率来克服。相板技术的最新进展，特别是直接电子探测器已经将可实现的分辨率推向了近原子范围[10]．

然而,尽管低温-em.提供感兴趣它既不适合的更大的区域扫描，也不用于活体成像的区域的高分辨率快照。这些缺点可以通过相关显微镜技术如相关光学和电子显微镜（克服克莱姆)．克莱姆结合了两全其美。光/荧光显微镜被用于便于观察标记（例如绿色荧光蛋白活细胞成像;绿色荧光蛋白），以确定正确的时间和感兴趣的领域。然后该区域被进一步用电子显微镜（图4）的高分辨能力检查。一个令人兴奋的新的和有前途克莱姆发展是徕卡低温阶段，允许观察低温样品的光/荧光显微镜在温度低于-160°C.这不仅大大降低的荧光团的漂白，但也允许冷冻样本中的感兴趣的区域（通常荧光标记的靶标）的由光/荧光显微镜识别第一。然后将样品（同时仍然在低于-160冷却°C）可容易地转移到电子显微镜，以通过cryo-重温的高分辨率研究感兴趣的区域em.．

到目前为止，每一个分辨率都在增加em.去手牵手与有关结构和功能的重要的新生物学发现。并没有迹象表明，这种趋势将很快结束。

的em.校园科学配套设施有限公司（CSF）的设施承认，从科学，研究与经济奥地利联邦外交部和维也纳市的资金。

1. Dubochet J, Adrian M, Chang J-J, Homo J- c, Lepault J, McDowall AW, Schultz P:玻璃化标本的低温电子显微镜。夸脱。生物物理学报。21:129-228(1988)。
2. Resch GP, Brandstetter M, Pickl-Herk AM, Königsmaier L, Wonesch VI, and Urban E:浸泡冷冻生物标本:原理，原理和仪器。冷泉哈布。议定书7:778-82(2011)。
3. Bigalke JM，Heuser先生T，尼卡斯特罗d，和Heldwein EE：HSV-1核出口复合体导致细胞膜变形和剪切。Nat. Commun. 5: 4131 (2014)．
4. 尼卡斯特罗d，施瓦茨C，皮尔森Ĵ，Gaudette R，波特ME，和McIntosh的JR：轴丝的分子结构所揭示的冷冻电子断层摄影术。科学313（5789）：944-48（2006）。
5. Heuser T，Raytchev M，Krell J，Porter Me和Nicastro D：Dyniin监管综合体是尼西亚联赛和芝麻和鞭毛的主要监管节点。J.细胞Biol。187：921-33（2009）。
6. Heuser先生T，Dymek EE，林静，史密斯EF和尼卡斯特罗d：CSC的连接参与动力蛋白调控三大轴丝复合物。摩尔。BIOL。细胞23：3143-55（2012）。
7. Pigino G，裴KH，Maheshwari A，Lupetti P，迪纳d，和Ishikawa T：在纤毛和鞭毛径向辐条的冷冻电子断层摄影术。J.细胞Biol。195（4）：673-87（2011）。
8. 林静，冈田K，莱切夫男，史密斯MC，和尼卡斯特罗d：动力蛋白动力冲程的结构机构。NAT。细胞生物。16（5）：479-85（2014）。
9. Carbajal-González BI, Heuser T, Fu X, Lin J, Smith BW, Mitchell DR, and Nicastro D:真核鞭毛中心对复合体的保守结构基序。Cytoskeleton 70: 101-20(2013)。
10. Grigorieff N：直接检测回报为电子低温显微术。网上生活2：e00573（2013）。
11. Gao Y, Berciu C, Kuang Y, Shi J, Nicastro D, Xu B: studies on nanoscale self-assembly of nonfluorescent small molecules in live哺乳动物细胞。ACS Nano 7(10): 9055-63(2013)。