长期增强作用(LPT)研究
我们的实验室研究啮齿类动物的新皮层和海马体的学习和记忆。我们感兴趣的是在最基本的层面上了解信息是如何储存在大脑中的。这一直是该领域难以回答的问题，因为信息不仅编码稀疏(只有几个突触)，而且分布广泛(在许多大脑区域)。
编码任何一段记忆所需的突触数量都非常少。例如，如果有10个15你大脑中的突触，可能只有几十到几百个分散的突触来编码任何一条信息。这是你能想象到的最糟糕的大海捞针的情况。为了解决这个问题，我们的实验室研究了长期增强(LTP)。LTP是细胞在短时间内增加和维持突触强度的生理机制，以秒为单位，但可以持续几天、几个月或几年。
实验方法
我们的工作是从切片记录开始的，但仅测量生理活动不足以区分一个突触和另一个突触。这促使我们的实验室寻找与观察到的生理活动的生物学相关性。当我们诱导LTP时，我们发现了发生在孤立突触上的重要的第二信使信号级联或磷酸化事件。
具体来说，我们关注的是发生在神经元过程中的细胞骨架变化等结构事件。我们发现并观察了调节这些ltp诱导的细胞骨架结构事件的酶。这一发现非常重要，因为它使我们能够在单个突触的水平上可视化信息编码的位置。
该实验室开始了电生理学方面的工作，用电极刺激新皮层和海马切片来诱导LTP。我们和其他研究人员表明，LTP发生的结构变化似乎是永久性的，但第二信使信号(磷酸蛋白水平)是暂时的。因此，在刺激后，我们立即固定组织并用磷酸蛋白特异性抗体标记它。
在这样做的过程中，我们在过去五分钟左右发生的单个突触上获得了ltp样活动的功能标记。我们还用PSD95特异性抗体对切片进行反染色，PSD95是一种只在兴奋性突触的突触后密度中发现的蛋白质。这使我们能够确定突触本身的位置。在这项研究中，我们发现在具有高水平磷酸化蛋白的突触数量和LTP之间有很好的相关性。
从那里我们进入了学习研究。虽然我们已经在人工刺激下找到了LTP的一个很好的标记，但我们想看看在自然学习环境下，这些事件是否以及在哪里发生在动物的大脑中。
为了解决这个问题，我们的实验室开发了一种称为无监督学习的学习范式。它不同于条件学习或联想学习，因为动物没有实验者给出的明确线索;动物们被允许在一个复杂的环境中漫步30分钟。然后我们快速冷冻大脑，准备切片。
测量和映射突触
最初我们瞄准海马体，因为我们知道它参与了这种形式的学习，但我们只关注海马体中非常小的区域，因为绘制信息的任务是非常劳动密集型的。我们发现，经历过学习环境的动物有更多的具有密集水平的磷酸蛋白的突触，这表明海马内突触上的ltp样活动。
从那以后，我们发现了一些非常令人兴奋的东西，与我们的一个更大的问题有关，即这些信息究竟存储在哪里?我们扩大了学习研究的范围，在整个海马体中选取相邻的区域。在这项研究中，我们与徕卡微系统公司密切合作，开发了自动化显微镜，以便我们能够以188金宝搏的网址高分辨率扫描整个部分。
我们将其与内部开发的复杂分析系统相结合。为了让你们知道我们检查了多少个突触，在我们发表的第一个LTP和学习研究中我们测量了几千个突触。在随后的论文中，我们测量了多达一百万个突触。现在，对于海马体的一部分，我们测量到大约2亿个突触，而对于整个海马体，我们测量到超过10亿个突触。这是一只动物的。因此，在一项研究中，数千亿个突触正在被测量和绘制，这是非常了不起的。
显微学与数学
我们一直使用直立荧光显微镜，获取双通道，三微米厚的z型切片，以重建3D免疫荧光图像。我们面临的挑战是在组织切片中保持不同深度的光学切片，以匹配最佳的标记平面。要做到这一点，我们需要一个自动对焦，可以聚焦在微米大小的单个球体上，也就是我们标记的突触。在这方面，我们发现Metamorph的算法非常适合。此外，该软件还提供了从相邻位置出发并找到最佳标记平面的灵活性。我们尝试了很多程序，甚至在我们发现Metamorph之前，我们尝试着自己编写软件。
现在我们每天24小时不停地收集图像，以便收集足够的数据来生成大比例尺的地图。我们发现使用内部滤镜转塔会减慢我们的速度，对显微镜造成太多的磨损，所以我们投资了快速的外部滤镜轮。我们现在已经组装了一个系统，它具有非常低的机械磨损，可以稳定可靠地连续运行几天。
使用这个新系统，我们开发了一个工作流，Metamorph在其中执行图像采集，一旦图像采集完成，我们就使用定制编写的软件将其发送到我们的云分析系统，该系统立即开始分析。这些图像经过反卷积，然后通过图像分割进行分析，这些都是我们在过去三四年里开发的内部定制软件。简而言之，我们已经从一项最初需要六个月来成像和分析的研究，变成了我们大约一周就能完成的研究。速度的提高使我们能够绘制出较大的大脑区域。
在我们的图像分割分析中，我们正在寻找直径约为200纳米的物体。我们分别对每个通道进行图像分割。然后，我们通过比较为每个对象标识的边界来识别共定位(更好的说法是共置)。我们发现含有密集磷蛋白标记的兴奋性突触的数量在2 - 5%左右;这是一个非常稀疏的信号，因为我们期望从一个大容量的存储系统。
我们在第一篇论文中使用了共聚焦显微镜，但我们后来选择使用宽视场显微镜和反褶积，因为获取速度更快。我们知道，我们能够获得的分辨率不如激光扫描系统，但我们愿意接受这种权衡，以获得我们当前系统所允许的速度和效率。
我们还发现，我们正在观察的元素，被光漂白得很快的模糊标记的元素，不能用共聚焦显微镜识别。另一方面，反褶积可以保留光线，从而更容易识别突触。
展望与结论
在这个项目中，有许多事情即将发生。我们将引入多种学习模式，并扩大我们分析的大脑区域的数量。我们也一直在努力提高系统的效率。
长期以来，人们一直相信，不同的大脑区域负责不同形式的学习，这得到了损伤研究的证据支持。但我们不知道与学习相关的信息是否存储在这些大脑区域中，也不知道这些区域是否执行系统或特定学习形式所必需的功能。为了解决这些问题，我们的实验室将继续努力，以经验为基础，了解信息在大脑中是如何以及在哪里被处理的。
