如何利用终身成像技术揭示研究中隐藏的维度

绝大多数的成像实验测量荧光强度，但荧光还有另一个关键的信息丰富的特性——它的寿命。每个荧光实验都可以免费获得终生信息。它可以提供有价值的新见解，但在大多数情况下，由于技术上的限制，它从未被收集。直到最近，人们认为终身成像对于日常显微镜应用来说太慢、复杂和昂贵，特别是那些涉及活细胞成像的应用。但这一切都在迅速改变。随着今天的先进技术，终身成像比以往任何时候都更快速和更容易使用。在这篇综述中，我们探讨了什么是生命时间成像，以及它可以给您的研究带来的优势，横跨广泛的应用领域。

自从显微镜发明以来，生物学家一直在利用光的特性来观察细胞内部。荧光分子已经成为细胞生物学家必不可少的工具。它们被广泛应用于显微镜，以可视化许多不同的结构，目标和动态过程的细胞，组织，甚至整个生物体。在过去的一个世纪里，研究人员开发了一个不同的荧光探针工具箱，其颜色(发射波长)跨越了
光谱从紫外线远红。

但是荧光不仅仅是颜色。每种荧光分子也有一个特征寿命，反映了荧光团在发射光子之前处于激发态的时间(图2)。对于给定的荧光团种群，光子在脉冲激发后的一定时间内会被检测到。对于每个荧光团物种，这些观察到的寿命的分布遵循指数衰减函数，从中可以计算出一个荧光衰减常数τ。

荧光寿命成像(这部电影)，在每个像素处确定τ，然后转换为空间地图。这一过程产生的终身图像看起来就像传统的强度图像。然而，每个像素代表的不是荧光强度，而是在该样本位置的值τ。

当要了解你的样本中发生了什么，荧光强度测量只能告诉你故事的一半。生命周期分析提供了丰富的附加信息，以帮助提高常规共聚焦实验的质量，在探针选择方面给您更多的自由选择，并实现新的应用。

寿命参数对于区分同一样品中的不同荧光物种特别有用。即使两种荧光染料具有相同的颜色(即紧密重叠的发射光谱)，也可以根据它们的寿命来区分它们。此外，您可以利用您的样本中自然自发荧光的生命周期信息来增强图像对比度
进行无标签实验。

与荧光强度不同，寿命无关。在探测浓度是不可预测的或在样品上可变的情况下，这可能是一个大益处。同时，终身探针可能对样品中的当地环境条件进行了精致敏感，使您能够通过常规技术监测细胞内温度，pH，离子浓度，极性和许多其他参数的动态变化。

最重要的是，寿命参数是荧光分子的固有特征，所以寿命数据可以“免费”与每个荧光实验。你只需要收集它!

1.减少神器出现的机会

荧光团的强度随浓度，光源强度和许多可能与您想要学习的现象无关的许多其他变量。荧光寿命的主要优点是它与荧光团浓度和限制强度测量效用的其他因素无关。

荧光团在特定的微环境中始终表现出相同的寿命，无论其浓度或测量方法如何。

因此，通过测量荧光寿命，可以减少由光漂白，非均匀照明，可变仪器设置（例如光路，激光强度，曝光时间，探测器增益，在厚样品中不同的探头深度引起的伪影。

2.区分真实信号和不需要的自身荧光

几乎所有的细胞都含有结构成分和代谢物，当激发波长通过紫外线/可见光谱。这种天然存在的“自发荧光”通常与常见荧光探针的发射重叠，但通常它具有非常不同的寿命“签名”。在这种情况下，寿命成像可以提供区分来自自发荧光的真实信号的方法。

3.提高对比度

所谓的“不需要的”自发荧光可以包含有价值的信息。您可以使用来自自发荧光的生命周期数据来提高对比度并揭示样本中更详细的细节，而不是丢弃它。例如，来自线虫的组织学横截面中的解剖特征可能难以单独地与强度信息区分开来，但看起来更重要
不同的寿命成像(图3)。

4.自信地分辨更多的荧光团

多探头成像实验成功的一个关键因素是选择光谱重叠最小的调色板。不幸的是，许多流行的荧光染料有重叠的光谱。如果你的共聚焦显微镜有终生成像能力，你可以使用它来更好地区分不同的探针在你的样品。这不仅提高了你的结果的质量，它也为你提供了更多的染料选择。

除了增强日常的共焦实验外，终身成像还提供了一种可视化和量化生理学和功能的手段，使您可以使用基于强度的或比率测量来研究的生理学和功能。以下是3个流行的应用领域，终身成像可以帮助您提出新类型的实验问题并获得新颖的见解。

1.用无标记实验分析代谢

无标签分析功能成像的自发荧光 - 特别是研究新陈代谢 - 是一种快速增长的研究区。弗吉尼亚大学蜂窝影像蜂窝成像中心主任Ammasi PeriaSamy教授对使用进行了重大研究这部电影结合双光子激发功能成像。他在目前的研究中应用无标记生命成像技术来测量活细胞、组织和动物的代谢和线粒体功能障碍。代谢的核心辅酶，如FA D和NADH，提供自然的自身荧光(图4)。“你不需要标记它，”Periasamy教授说，“所以这种类型的技术对翻译研究很有用。”重要的是，他指出，寿命可以区分这些辅酶的结合态和自由态。“用高强度技术是不可能做到这一点的。”

2.研究分子间相互作用烦恼-这部电影

蛋白质、DNA、RNA和其他分子之间的相互作用是许多生物学的基础。一种现象称为Förster共振能量转移(烦恼可以利用以检测分子相互作用，并测量分子之间的距离在非常近距离的范围内 - 超过〜10nm的距离。

超出其用于测量分子间距离的实用性，能量转移原理烦恼供体和受体对也使敏感生物传感器的开发成为可能。许多今天的现代烦恼生物传感器基于遗传编码的蛋白质［1］经过设计的构象变化
使连接的供体和受体结构域在配体结合时更紧密，从而使a烦恼生成的信号。

基因编码的烦恼生物传感器特别适用于监视活细胞中的动态信号转导事件。例如，ERK信号通路是癌症中恶性细胞生长的关键驱动器。一种烦恼ERK的生物传感器已被用于监测活患者来源的类器官中ERK信号的癌症相关变化[2]．生命周期分析强调了结直肠癌患者类器官中ERK活性的增强(图5)这部电影记录对于这项高要求的3D成像研究至关重要。

3.用环境敏感探测器探索微环境

荧光寿命特别有用的性质是对局部微环境的潜在敏感性。这种现象是可能的，因为周围环境可以影响激发电子返回到地状态的可用途径。

如果环境因素增加或减少非辐射路径(那些不导致光子发射的路径)，那么荧光团的寿命将分别缩短或延长。

各种各样的环境生物传感器已经被设计来利用这种特性，其中许多是基于烦恼．在许多情况下，寿命成像可靠地检测到环境变化，否则在拥挤的细胞内空间中很难测量。特定的环境传感器可以监测温度，离子浓度(Ca2+， Na+等)，pH，极性，粘度，第二信使，如cAMP，和许多其他参数和小分子分析物。

一个特别具有挑战性的应用是研究亚细胞隔间(如线粒体和细胞核)内生物活动的温度依赖性，基于寿命的生物传感器提供了新的光。线粒体和细胞核是重要细胞功能发生的地方。传统的测温技术不能应用于单细胞水平，其中感兴趣的区域的尺寸范围从1μm到~100μm。为了解决这一问题，研究人员开发了分子温度传感器，如荧光聚合物温度计(FPT)，这是一种浓度无关的细胞渗透性聚合物，随着温度的升高，荧光寿命增加[3]．

Kohke Okabe博士和他的同事将FPT与时间相关的单光子计数(TCSPC)结合起来——这是最精确的方法之一这部电影检测方法 - 确定高度局部温度变化是否会影响细胞反应，例如应激颗粒形成和脑水肿。“这部电影不可或缺
以定量的方式来做我们的工作，”冈部冈部说。

集成这部电影终生成像是一个无价的工具，可以立即提高您的共焦实验的质量。它不仅允许你利用自然细胞自身荧光，它也给你在探针选择和多路复用实验更多的灵活性。小说的出现烦恼-这部电影环境探测为细胞研究和定量成像开辟了更多的可能性，使科学家能够提出新的问题，并对细胞结构和生理学方面进行量化，这是以前无法测量的。随着终身成像技术的不断发展，以前的限制，如光漂白和缓慢的数据采集速度正在变得越来越少的问题。快速视频速度这部电影解决方案，如FALCON技术[2]使更多的活细胞动力学应用。在未来，我们可以期待看到更多无缝集成的整体共聚焦平台这部电影进入日常成像工作流程。在系统操作、实验设置、数据分析和结果解释方面采用更方便用户的软件和交钥匙方法将有助于实现这一目标。Periasamy预测了一个光明的未来这部电影生物研究中的技术：“这是一种动态技术，肯定会继续前进。它将在所有生物学实验室和显微镜功能中提供 - 就像共焦[今天]。“