DNA双链断裂诱导基因编辑
自从20世纪50年代DNA被发现以来，研究人员的目标是了解这种普遍的生命密码。一方面，基础科学想要破译基本现象和机制。另一方面，应用科学，如生物技术或医学，试图利用这些信息来培育更健壮的作物或治疗疾病。
所有对DNA及其相关表型感兴趣的研究人员的共同方法是修改．为了找出某一特定基因及其相应蛋白质的作用(通过基因表达)，一个明显的策略是去除它(敲除)或修改它(突变)，然后观察结果。这就是为什么多年来开发出了几种改变基因组信息的技术。
使用细菌衍生限制性内切酶（EcoRI，BamHI，HindIII在特定的位置切割DNA是基因改变方法的一个例子。这些酶用于分子克隆，即融合重组DNA以在宿主生物中表达。每一种限制性内切酶只有一个特定的DNA序列可以切割。连接酶将目标DNA片段融合成质粒载体．克隆过程在体外进行，重组DNA质粒必须被转移回细胞中以产生相关的蛋白质。
一种在基因内源性状态下操纵基因的方法，即直接在目标细胞的固有基因组中，由于发现同源重组(人力资源)。利用序列同源性可以将外源DNA片段引入到目标基因组中。在少数情况下，与目标序列具有同源性的DNA片段可以通过重组整合到基因组中(十分之一)6-10年9细胞）。这一发现促进了敲入（添加了一个或多个基因）和敲除动物的产生。
尽管有了这些进展，同源重组这一罕见事件仍需要改进。幸运的是，进一步操纵DNA的方法出现了。人们发现另一种类型的核酸裂解酶-核酸酶-可以被编程并用于基因操作。首先，我们开发了三种主要的蛋白质类。Meganucleases来自细菌,锌指核酸酶(ZFN)基于真核转录因子转录激活物样效应器核酸酶(取得)所有的细菌都通过蛋白质-DNA相互作用来识别它们的DNA结合位点。大核酸酶本身有一个DNA结合结构域和一个核酸酶结构域，而ZFs和TALEs则附着在一个FokI核酸酶结构域上。
原则上，基于大核酸酶、ZFN或TALENs的基因组编辑技术也使用同源重组引入一段外源DNA，但它们不会等待双链断裂意外发生。由于它们的序列特异性和核酸酶活性，它们能够产生靶向DNA双链断裂(双边带)为基因座特异的同源重组创造了空间。
现在更详细地说，有两种机制可以发生在DNA双链被切割之后。两者都是内源性DNA修复机制的一部分，依赖于足够的同源修复模板的存在(见图1):
一)异源end-joining(NHEJ)发生在缺乏外源性同源修复模板的情况下，可以引入插入或删除(indels)，最终导致移码突变或基因敲除。
B)Homology-directed修复如果一个外源性修复模板(例如，一个被操纵的基因)可用，并可以通过修复机制产生精确的基因修饰，将其插入到打开的DNA链中，就会发生HDR。
CRISPR/Cas细菌免疫系统
CRISPR/Cas系统首次发现于20世纪80年代，当时研究人员对细菌基因组进行了更近距离的研究。在最初研究某些酶时，他们发现了目标基因序列下游的重复元素。这些重复元素依次被非重复序列间隔。随着越来越多的基因组测序，结果表明，这些间隔重复序列在许多细菌和古菌的基因组中都是保守的，这表明这可能是重要的事情。由于它们的特点，它们被命名为有规律间隔的聚簇短Plindromic重复或CRISPR．
下一个决定性的发现是在2005年，当时对重复元素之间间隔的分析揭示了它们的细菌外起源。相反，它们属于噬菌体(病毒)的基因组。然后一个有趣的发现出现了:携带某些噬菌体DNA元素的细菌不再被它们感染。这一结果导致了新发现的遗传元素可能属于一个复杂的原核免疫系统的结论(见图2)。
随后的研究证明了这一理论是正确的，并揭示了有几种不同的基于CRISPR的系统，它们最终都导致了病毒DNA的降解，分别是RNA。CRISPR的基本原理是将外源DNA片段整合到细菌基因组中，并利用它们的转录本作为基质进行碱基配对，诱导病毒DNA的结合和破坏，以应对未来所有的感染。下面将更详细地介绍CRISPR机制。
细菌细胞的感染始于噬菌体，在噬菌体表面停靠，将其遗传物质释放到细菌中(见图3)。同时，一些CRISPR位点上游的基因得到表达。由于它们的位置和功能，它们被命名为CRISPR相关基因或简称中科院. 他们的基因产物能够从外源DNA中切割出不同的片段，称为Protospacers．随后，原间隔体作为DNA序列间隔体插入CRISPR位点。
CRISPR位点的转录形成一个由许多间隔位点和重复位点组成的pre-crRNA，之后再对其进行加工。成熟的crRNA只包含一个重复序列和一个间隔，可以被不同的CRISPR/Cas系统利用，通过沃森-克里克碱基配对来靶向外源DNA。I型、III型和IV型系统由大的Cas蛋白复合物组成，而II型(即Cas9)和V型(即Cpf1)系统仅由两者的单一蛋白组成DNA的目标和分裂．除了crRNA外，Cas9系统还包括另一个叫做tracrRNA(反式激活crRNA)的短片段，它与crRNA的间隔部分杂交。
所有CRISPR/Cas系统的最终结果都是一样的:在crRNA引导Cas蛋白与同源段结合后，外源DNA被降解。细菌CRISPR位点内的间隔段与病毒DNA由相同的序列组成，这一事实提出了一个问题:为什么Cas蛋白不能识别细菌DNA中的间隔段?
奇怪的是，对于系统I和系统II来说，存在着一种区分自我和非自我的机制。Cas蛋白质需要一个所谓的帕姆(原间隔体邻近基序)，一旦与病毒DNA链结合，就能有效地发挥作用。根据不同的生物体，PAM的序列可能不同。一种PAM来源于酿脓链球菌是5'-NGG-3'，其中N是任何碱基，G是鸟嘌呤。因为获得的病毒基因片段(间隔段)的CRISPR位点两侧的直接重复没有PAM, Cas9蛋白不会在那里结合。它只会由于感染而与入侵的病毒DNA结合。换句话说，在PAM的帮助下，CRIPSR位点免受自我毁灭的保护。
有关CRISPR/Cas原产地的更多信息，请观看视频谈话:CRISPR-Cas——从细菌适应性免疫系统到基因组工程工具．
用Cas9进行基因编辑
来自细菌II型CRISPR/Cas系统的Cas9核酸酶可用于基因组编辑。这意味着它能够引入外源基因或干扰内源性基因。在这些实验的帮助下，研究人员可以发现某些基因及其各自表达的蛋白质的作用。此外，他们还可以通过编辑基因组来修改生物体，以达到有益的目的，例如使作物更健壮、更容易种植。
在这类试验过程中，通常使用显微镜进行标本制备(如细胞培养工作)或观察转基因细胞或生物体的表型。
的Cas9基因编辑系统遵循与巨切酶、ZFNs或TALENs相同的原则:Cas9的核酸酶能够打通的DNA链定义网站和减少其产生的双链断裂使其受到上述DNA修复机制(见图4)。大Cas9和三个现有的基因编辑工具的区别是,Cas9使用一块为DNA靶向RNA。这个事实是很有利的，因为所谓的sgRNA(单导RNA)可以很容易地合成。无需费力地设计DNA结合蛋白，sgRNA可以通过PCR快速合成，与宿主DNA序列相对应。
sgRNA返回到原始CRISPR/Cas9系统的crRNA和tracrRNA。为了简化，crRNA和tracrRNA被引入一个环路融合，形成sgRNA。
然而，Cas9系统也有缺点。如上所述，Cas9核酸酶需要一个帕姆(Protospacer邻近基序)与靶DNA序列(3’端)的距离较近或不能有效工作，在一定程度上限制了其基因编辑潜力。
因此，为了利用Cas9作为基因编辑工具，只有在3'端两侧有PAM的DNA序列可以被修改。例如，上述5'-NGG-3'PAM使人类基因组平均每8个碱基对用酿脓链球菌派生Cas9 (SpCas9)。然而，来自其他物种的Cas9蛋白，如乳酸链球菌或脑膜炎奈瑟氏菌，有其他pam，这反过来扩大了Cas9工具箱的目标范围。
人们对Cas9系统最大的兴趣在于它可能用于多路复用编辑在哺乳动物细胞中，即通过添加多个sgrna来同时编辑不同的靶位点。Cas9系统的进一步优点和缺点如下表1所示。
巨核酸酶 |
锌指核酸酶 |
取得 |
CRISPR / Cas9 |
|
DNA结合分子 |
蛋白质 |
蛋白质 |
蛋白质 |
核糖核酸 |
起源 |
细菌 |
真核生物 |
细菌 |
细菌/古细菌 |
优点和缺点 |
-少量适合于目标DNA序列的大核酸酶蛋白残基 |
-高努力修改 -由DNA结合蛋白的模块化阵列组成 -它们之间的串扰影响序列特异性 -需要广泛的筛查 |
-高努力修改 -对于ZFNs来说，模块化结构可能存在上下文依赖的特异性 ——劳动密集型 |
+易于修改 +sgRNA的快速产生 +高度可定制 +多重靶向(多路复用) -需要目标位点的PAM序列 |
表1:基因组编辑工具的事实、优缺点。
Cas9系统的应用
将两种元素——Cas9和sgRNA——送入靶细胞有多种策略。
编辑细胞培养细胞系可以通过质粒转化来获得。这两个元素要么在同一个向量上编码，要么在两个独立的向量上编码。当计划插入或替换时，必须用额外的质粒或单链寡核苷酸(ssODN)转移供体DNA。
为了一代转基因动物，受精卵可以微注射纯化的Cas9蛋白和体外转录的sgRNA。体细胞基因修饰可以在编码Cas9和sgRNA的病毒载体的帮助下进行。
Cas9系统的一个主要优点可以在生成转基因动物．如上所述，将sgRNA和Cas9蛋白以及所需DNA直接转移到受精卵(受精卵)中就足够了。Cas9程序可以一次修改多个等位基因。相比之下，其他技术依赖于胚胎干细胞在被注射到胚泡(后期胚胎阶段)之前耗时的基因操作。干细胞程序提供杂合子个体进行长期的交配过程，最终与纯合子动物。在这种情况下，Cas9系统可以为研究人员节省大约一年的时间。
此外，Cas9系统也可用于成年动物。这种新的选择可能会促进治疗性基因编辑，并给研究人员治疗多种疾病的新机会。
除了作为基因编辑工具，Cas9系统还有很多其他潜在的应用。不仅可以利用DNA的切割功能，而且通过抑制核酸酶的活性，Cas9蛋白可以转化为一种高特异性的DNA探针。Cas9的这个功能可以完成广泛的任务。例如，Cas9蛋白可以融合到转录激活物中，用于靶向基因的表达。当与荧光蛋白结合时，Cas9蛋白可以标记不同的DNA位点，从而可以研究染色体动态。此外，已经建立了化疗和/或光激活Cas9蛋白来获得基因表达的时间控制。
前景
用于基因编辑的Cas9核酸酶来源于细菌抗病毒CRISPR/Cas9系统。与合成的sgRNA结合，研究人员可以比以前更容易、更快地敲除或敲入基因。这一发展为基础研究，特别是药物开发或医学治疗学创造了新的机会。188bet怎么注册此外，应用科学将有可能创造更有利可图的作物或微生物，以生产各种基础材料。
Cas9系统还具有促进基因治疗的潜力。人们可以想象直接消除产生疾病的有害突变，或者从t细胞中去除HIV基因序列，以避免艾滋病的发作。
除了它对分子生物学的主要影响外，许多显微镜应用都来自于Cas9核酸酶，例如内源性蛋白标记，基因位点的动态成像，或光激活转录系统的发展。
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