荧光显微镜的后一体主义时代：分子，细胞和组织
肿瘤学研究已经深入地参与到这一变化过程中，认识到无菌方法的风险完全基于在体外模型。针对特定分子的治疗需要实现一个英国航空公司特征维从分析单分子生化结构开始，延伸到它们在细胞内和细胞间水平上在细胞环境中的作用。随后，分析的场景从克隆性肿瘤种群演变为肿瘤和宿主之间建立的复杂的相互作用网络，首先在组织活检中检测，然后在活体动物模型中检测。
现代光学显微镜一直是生物医学研究不可或缺的工具，它的发展是为了适应实验方法所瞄准的样本的巨大异质性所要求的不断变化的要求。188bet怎么注册除了在某种程度上明显需要逐步提高分辨率外，光学显微镜现在必须将其非侵入性分析能力从单个细胞扩展到整个生物体，最大限度地减少观察过程中对生命的干扰。
多光子激发显微镜的革命代表了观察复杂生命系统的一大步[1］．红外线高频源提供无与伦比的穿透深度。能够容易地诱导荧光紫外线可兴奋分子已成功地用于监测浓度和功能的代谢和结构标记体内，如NADH和胶原蛋白。开发的分析支持了双光子显微镜在临床试验中的先进性，实现了诊断皮肤肿瘤的“光学活检”的第一个方法[2］．
现代显微镜最相关和最成功的转变之一是能够将仪器改造与功能参数测定的新分析方法的发展并行。除了纳米技术这一新兴领域，以4Pi和st显微镜可以缩小光学和电子显微镜之间的空间分辨率差距，我们对单分子物种特性的见解从新的功能显微镜分析和技术的诞生中获得了相关的优势。这一过程最终导致了“F技术”的重新发现，即光漂白后的荧光恢复(Frap.)、荧光共振能量转移(烦恼）和荧光相关光谱（FCS)，用以研究分子动力学和相互作用。
接下来，我们将重点关注特定的应用，提供一些“标准”共聚焦显微镜如何在日益复杂的水平上承载肿瘤研究的例子。从单个孤立分子的性质开始，我们将转向它们在活细胞生化网络中的作用，从静态均质样本(在体外细胞培养群体）组织学分析的内在异质性。
图1:用于表征化学反应动力学的光漂白后的体外荧光恢复(由A. Musacchio, M. Vink提供)。A:在适当的实验条件下，化学二元体系中各组分浓度的时间演化是用具有直接解析解的微分方程来模拟的。其中一种被固定在表面上(盖玻片，琼脂糖珠)，而另一种被荧光分子共价标记。配合物的形成伴随着覆盖层上荧光信号的积累。荧光强度的时间行为是由缔合和离解速率决定的，这取决于溶液中配体的浓度。B:与化学动力学相比，在无重结合和快速扩散的假设下，表面光漂白后的荧光恢复完全取决于离解速率。半恢复时间与所研究的分子复合物的半衰期一致。C:这幅图显示了荧光信号强度的演变。第一相的特征是达到化学平衡。然后，对表面的配合物进行漂白和恢复观察。 The different temporal behaviour of the two phases can be consequently appreciated.
分子：功能纳米镜。化学反应动力学的特征
复杂生物化网络的研究从简化的实验模型开始在体外由纯化生物分子组成的二元体系。目前，化学反应动力学参数的测量主要采用等温量热法和/或表面等离子体共振法，获取和维护成本较高。
共聚焦显微镜，特别是光漂白后的荧光恢复(Frap.)的协议可以提供一个有效的替代方案，最近发表的一篇论文描述了“纺锤体组装检查点”基础上的分子机制[3.］．在Frap.方案光漂白被用来灭活目标区域内的荧光分子。分子迁移导致荧光信号的恢复通过取代漂白的荧光分子。信号恢复的速度代表了分子迁移率的指数，由分子所在环境(不同的细胞隔间)中的扩散系数和与其他分子物种的相互作用决定。当一个单一分子物种被固定在一个表面上，并暴露在溶液中荧光标记的第二个相互作用分子中，将检测到发射信号的增加，直到达到化学平衡(图1)。
强度的时间演变将通过与系统中反应物的浓度成比例地统治和解率。然而，上述表面的光漂白区域中的荧光的恢复将不再取决于这些参数。在适当的假设下，即扩散过程比化学反应快得多，替代漂白分子的限制步骤是现有复合物的拆卸。因此，半恢复时间与所研究的分子复合物的半衰期一致。荧光时间演进图的比较显示了两种过程的动力学的差异：达到化学均衡的达到更快的时间尺度，而光截面没有打扰所获得的化学平衡，因此由半衰期排除出来现有的复合体。
蜂窝网络：突出分子通量
生活细胞提供了验证的完美目标Frap.协议。通过完美程度的空间和时间间隔，实现机制的协调。除了Frap.通过克隆荧光蛋白的光激活/光转换变体，我们跟踪分子运动的能力获得了显著优势。有选择地打开荧光的可能性，产生一个高度局部的信噪比增加，极大地促进了活细胞和生物体的分子和细胞跟踪。基于共聚焦显微镜的光漂白/光活化协议的一个强大的限制来自于无法控制目标体积的深度:一个聚焦的高斯激光束本质上将提供足够的高能量密度光激活/光漂白的分子内的照明锥的目标跨越几个微米。
使用具有固有有限激发的光学装置开辟了完全控制三维光转换过程的途径[4,5］．全内反射荧光显微镜(TIRF)，利用在具有不同光学性质的两种介质(即玻璃覆盖物和细胞膜)之间的界面上产生的倏逝电磁场所传递的能量，能够光激活细胞区域内跨越基膜上数百纳米的分子。双光子显微镜能够在细胞内移动，瞄准有限衍射范围内的体积。将活化体积限制在三维的可能性为活细胞分析中一些具有挑战性的问题提供了新的工具。只有在双光子诱导的光转换下，在不涉及上、下膜的情况下，内吞噬囊泡的靶向光激活才能成功地用于证明从细胞质到细胞膜的循环分子通量的存在。
组织:三维共聚焦组织病理学
多年来，经典的组织学分析都是基于光学显微镜，仅略微进入荧光显微镜领域。现代共聚焦显微镜的发展，特别是光谱检测系统的诞生，高度自动化和非线性激发革命最近激发和加强了激光扫描共聚焦显微镜和组织学分析之间的相互作用[6］．组织病理学样本代表了后基因组革命所需的分析材料的复杂性重新调整的第一步。这种复杂性使得丰富的材料成为光传播的艰难环境。在分析这种复杂的样品时，光散射有用，即光谱反褶积。对被分析材料的光物理特性的测量可以帮助理解组织组成和设置最佳的荧光团组合，以便在高含量分析中最大限度地实现可分析参数。
下一步是获得衍射受限观察，在非常宽的视野下确定细胞内参数，允许识别组织组织的独特束。实现这样一个具有挑战性的任务需要马赛克方法，可以利用自动化阶段或智能使用扫描镜共聚焦显微镜。该方法用于测量正常人类肠道组织活检中不同组织腔室中早幼粒细胞白血病蛋白核小体的大小分布(图3)。视野(360 × 360 μm)2)通过合并16个不同的面板，采集的采样像素约为80 nm。这样的分析表明了细胞内特性和组织学区域化之间的相关性。在体外研究归因于PML一种抗增殖效应。肠土地区的PML核体的平均尺寸和强度低于周围结缔组织中计算的值，表明蛋白质含量和增殖之间的相关性，隐窝是高复制活性的位点。
参考文献
- Diaspro A.等:多光子激发显微镜。生物医学工程在线5(2006)36。
- 临床双光子显微内窥镜。Microsc Res Tech 70(2007) 398-402。
- Vink M.等人：体外FRAP识别Mad2 Kinetochore动态的最小要求。Curr Biol 16（2006）755-66。
- Diaspro A等人:利用双光子相互作用在活细胞中对pa-GFP进行三维局部光激活。ieeeeng Med Biol Soc 1(2006) 389-91。
- Schneider M，Barozzi S，Testa I，Faretta M，DiaSpro A：在720-920-nm区域中PA-GFP的双光子活化和激发性能。Biophys J 89（2005）1346-52。
- transsidico P, Bianchi M, Capra M, Pelicci PG, Faretta M:从细胞到组织:荧光共聚焦显微镜在组织样本的研究。Microsc Res Tech 64(2004) 89-95。