共焦和数字光片成像

如果可以只记录焦点特征和测量相对z位置，我们就可以解决焦点深度问题:在记录一堆图像后，我们就可以重构整个样本，而不包括模糊部分，并在所有三个维度量化对象。

最常见的是共聚焦显微镜[１]当提到光学切片时要记住。共焦原理无缝集成到标准光学显微镜(尽管技术集成需要相当多的修改)。与普通的光学显微镜不同，真正的共焦成像需要单个光点尽可能小的照明。光斑直径由波动光学控制，在d≈λ/NA处达到衍射极限的最小值。详细的强度分布由点扩散函数描述。与此同时，探测器还必须探测到尽可能小的点。由于光路是对称的，同样的数学方法也适用于点状探测器的传感分布。点检测器是通过在检测路径的中间像面上引入小孔孔径来实现的。在样品中，照明焦点和检测焦点必须重合，因此采用“共聚焦”显微镜。如图1所示，这个针孔的作用是光学去除所有不是来自焦平面的光线。 Its function is that of a spatial filter in z-direction.

由于光学刀一次只能在一个点上工作，这个点必须从上到下按直线移动，以生成图像。强度被同步转换成数字信息并存储在计算机上的帧存储中。从这个电子存储器，图像显示在一个普通的监视器上。由于图像必须按顺序逐点构造，高帧率只有在某些影响帧格式和接受的信噪比的限制下才有可能。高度透明的光束路径，比如徕卡SP检测器和非常高效的传感器，如混合检测器(HyDs)有助于提高高帧率性能。同时，在共聚焦显微镜中实现高达12,000 Hz的线频率，而在pal标准电视中实现约15,000 Hz的线频率。在适当的条件下，高达每秒500帧的帧率是可能的。尽管如此，为了获得足够高的信噪比图像，帧率通常不会超过每秒10帧左右。

与扫描过程相关的另一个问题是，焦平面上下的样品区域暴露在大量的照明能量下，这对成像没有帮助，但可能导致荧光色素的光物理降解。由于荧光色素吸收的光也在焦平面以上，当聚焦到样品深处时，荧光强度越来越弱。这可以通过自动增益适应来补偿，但代价是信噪比。

真正的共焦成像的积极方面是高分辨率(高na镜头很容易应用)，事实是图像在焦平面内固有的均匀性，标准的制剂很容易和费力地用共焦显微镜分析。共焦显微镜是基于标准的同轴光学显微镜，所有的标准显微镜方法和对比度模式都可以通过一个简单的开关来实现。它也是其他类型扫描显微镜的基础，如多光子激发，高谐波产生显微镜，相干反斯托克斯拉曼散射显微镜和超分辨率技术发生的(受激发射耗尽显微镜)。

虽然共聚焦显微镜是光学切片的金标准，但第一个完成这项任务的显微镜在半个世纪前就出现了。“Spalt-Ultramikroskop”［2］使用一个明亮的光源(弧光灯或太阳)聚焦到一个狭缝孔。第二个透镜，通常是一个重复使用的物镜，将这个狭缝投影到与显微镜光轴正交的标本中。这种设计有效地创造了大约两微米厚的薄片式照明。最初的应用与亚分辨率粒子有关，比如有色玻璃中的分散金。它对化学和医学研究中常用的各种胶体样品和混浊介质都很有用。188bet怎么注册早期的光片显微镜只能看到5纳米以下的微小粒子，这导致了照明的球形散射，在显微镜的垂直光束路径上可以观察到衍射模式。其结果是，它能看到被称为“Ultramikronen”的不可分解粒子，这些粒子“超出了显微镜的分辨能力”。“超显微镜”这个名字首先暗示了一种超分辨率的设计，但作者明确表示，超显微镜显然受到了光学衍射的限制。

图2:Spalt-Ultramikroskop光路示意图。激发光通过物镜1通过狭缝(Spalt)聚焦到样品中。发射物由物镜2收集，并可由照相机记录为光学部分。

后来，又开发出绕过精密狭缝的设计，并使用筒形透镜创造出垂直于光轴的光片[３]．这种安排随后用于荧光固定样品。光板显微镜被证明特别有利于厚样品的快速实时成像，因为漂白不太明显，而且图像记录是由数码相机并行进行的共焦和数字光片成像如Huisken所示［6］．z方向上的吸收不是问题，因为在显微镜聚焦的z方向上的所有位置上的照明都是相等的。然而，在普通显微镜下，发射光必须像通过样品一样，这可能会在一定程度上影响厚样品的成像。然而，在横向上仍然存在阴影效应:光线首先在照明光线进入样品的一侧被吸收，因此荧光在相反的一侧变暗。Voie[３]通过旋转样本和从不同方向收集图像来补偿这种效果。Dodt［7］从相反的两边照亮样品，以补偿光片的吸收。不要用投影狭缝光圈或圆柱形透镜，凯勒［４］扫描垂直于观测轴的细激光束。这个方案被称为“数字扫描光板”。

在生物医学研究和常规中介绍了两种范式，为生物概念和疾病的许多新的见解和谅解，以及细胞188bet怎么注册组分的构建和功能。在仪器方面，两种方式显着不同，正交照明被视为系统的单独部分并与同轴显微镜组合以执行任务。共聚焦显微镜使用光束扫描系统来创建TwoDimensional图像，数字扫描的灯纸使用波束扫描来产生来自线的区域。这立即提出了是否有可能在一个系统中结合这两个策略的问题。188金宝搏的网址Leica Microsystems在新徕卡介绍了这种组合TCSSP8DLS光片显微镜［5］．

徕卡TCSSP8DLS它基于普通的共聚焦显微镜，一种同轴扫描装置，通过探测针孔对离焦光线进行空间过滤来进行光学切片。图像是通过电流扫描镜在两个横向方向移动照明点产生的。要将这样一个系统转换成数字光板显微镜，必须使照明光束垂直于光轴穿过样品。通过在焦平面的位置引入一个小镜子，刚好在观察场之外，实现了所需的正交照明。这种偏转镜被机械地连接到观察透镜上，以确保被照亮的z位置总是在成像光学的焦点上，而图像被投影到摄像机上，将强度转换成数字图像。

光照光束的单个位置不会产生二维图像，而只会产生单线。可以利用共聚焦显微镜固有的横向扫描模式，在垂直方向上扫描照明线，得到所需的二维平面。

如果在相反的一面引入第二个镜子，就可以通过同一个透镜从两个侧面照亮样品——只需要使用共聚焦显微镜的光束扫描装置的第二轴。这就满足了对吸收引起的阴影进行补偿的需要。最后的图像再由两张不同光照方向的图像构建。

为了在共焦模式下成像，z驱动机构必须进行定位，使照明光束的焦点与要成像的特征重合。扫描过程只覆盖视野的内部，这是操作共聚焦显微镜的常见方法。要转换到光片采集，焦点必须移动大约镜面到光轴的距离。在这种情况下，照明光束的平面产生部分将落入观测场的中心。扫描设备需要指向视野的边缘，以击中镜子。

这种组合不仅降低了仪器成本，因为两个不同的仪器合并为一个，但它也允许传统共聚焦和数字光板显微镜的组合。因此，同样的系统允许使用最适合解决当前研究问题的技术来探索任何样本。它还提供了各种新的应用机会，因为共焦路径可以用于诱导效应的后续柔和光片成像的光操纵。

1. 明斯基:显微镜仪器。美国专利3.013.467，申请7^th一九五七年十一月，批准十九^th1961年12月(1961)。
2. Siedentopf H和Zsigmondy R: Über Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikroskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser。安。理论物理。Iv(10): 1-39(1903)。
3. Voie AH, Burns DH和斯佩尔曼FA:正交平面荧光光学切片:宏观生物标本的三维成像。光学学报，29(3):362 - 368(1993)。
4. Keller PJ等:利用扫描光镜重建斑马鱼早期胚胎发育。科学322:1065(2008)。
5. Knebel W和Sieckmann F: Verfahren和Anordnung zur Beleuchtung einer Probe。德国专利申请，出版物编号:DE 10 2011 054 914 A1(2011)。
6. 引用本文:Huisken J等:利用选择性平面照明显微镜对活胚胎深部进行光学切片。中国科学(d辑:地球科学)。
7. Dodt HU等:超微:整个小鼠大脑神经元网络的三维可视化。方法4(4):331-36(2007)。