以往方法的局限性
足细胞是肾脏肾小球滤过屏障的关键细胞成分1．然而，它们是终末分化的，因此在正常条件下无法完成成功的细胞分裂。因此，足细胞减少(每个肾小球的总数或每个肾小球的密度减少)是肾病进展的一个重要指标2．足细胞耗竭已经成为肾小球疾病的统一原则，迄今为止，组织学切片上通过计数每个肾小球横截面的足细胞核来常规评估3.．最近的研究强调了这种方法的局限性，包括低水平的准确性和精度，以及高度的生物变异性(特别是在小鼠研究中)。
体视学方法，无论是“基于模型的”还是“基于设计的”(无偏)方法，产生从取样部分确定的足细胞数量的估计。基于模型的方法需要足细胞核大小和形状的知识或假设。一般来说，这些值是假设的，如果这些假设与真实值不同，得到的估计是有偏差的。基于设计的体视学方法用于估计足细胞数量是非常耗时的，并没有被少数实验室采用。使用连续组织学切片估算足细胞数量的替代方法4(“详尽的枚举”)是极其乏味和费力的。
组织清除和光学切片的结合使新的方法成为可能
幸运的是，新的组织清理技术的出现5结合光学切片，可以通过共聚焦、多光子或光片显微镜实现，现在使详尽的枚举不仅有吸引力，而且对足细胞定量和任何其他感兴趣的细胞，特别是那些在疾病的发展和进展中发挥核心作用的细胞有显著的改进。
我们采用了这种方法，并开发了一种新的、高效的方法，利用免疫荧光、光学清除、共聚焦显微镜和3D分析来研究足细胞的耗散6．该技术已被用于定量表达人白喉毒素(DT)受体的转基因小鼠足细胞耗竭的特征，这允许有条件的和剂量依赖的足细胞死亡。
我们的定量形态学工具显著改善了足细胞耗竭的评估，并允许整个肾小球穿过肾皮质的研究。不同肾脏肾小球间足细胞耗竭的差异可以被发现，这是局灶性肾小球疾病研究的一个重要进展。
一种成像和定量足细胞耗尽的新方法的发展
福尔马林固定的肾脏切片至800 μ m厚，然后使用改进的免疫荧光方案对切片进行1小时抗原提取。将切片包埋在琼脂糖中，琼脂糖在甲醇中变化脱水，然后通过苯甲醇、苯甲酸苄酯(BABB)的几种变化进行清除。
通过将脱水琼脂糖的边缘粘在玻璃培养皿上，我们将厚的肾切片固定在培养皿的底部，使标本能够在直立状态下进行成像徕卡TCS sp8mp共聚焦/多光子显微镜配备专业的徕卡20x/0.95 NA BABB浸没物镜．所使用的BABB混合物的折射率为1.56，这也允许在需要时在倒置显微镜上使用x40和x63油物镜进行更高分辨率的成像。
足细胞计数时，800µm厚的肾切片分期平铺成像，以获得肾的全横切面。这有助于从浅表区域到髓旁区域的系统成像，以产生公正的结果。2mm厚的切片(代表该物镜的全部工作距离)也进行了成像，但通常使用800µm切片，以1µm间隔通过2-3个通道成像，提供了理想的分辨率、工作深度和总体成像时间。
最终的数据集为分析提供了可量化的足细胞微结构，以及完整的3D肾小球可视化。使用所有细胞核(DAPI)、足细胞胞浆(synaptopodin, SNP)和足细胞核(p57)标记，以及Imaris (Bitplane AG, Zürich, Switzerland)的掩蔽和计数特征，可以确定每个肾小球的分析:(i)总足细胞数(ii)平均足细胞体积(iii)单个肾小球体积;根据这些数据计算(iv)足细胞密度(每体积肾小球的数量);(v)平均足细胞核体积;(vi)平均足细胞胞质体积。
虽然图像分析组件不是完全自动化的，需要人工监督，但计数和分析明显比迄今为止所有其他方法更好和更快。一旦获得共聚焦图像，每个肾小球大约5分钟即可获得上述参数的值。
视频:肾脏切片三维显示肾小球。在大的组织切片上标记SNP，大约。800微米的厚度，由阶段平铺成像。
讨论和展望
标本制备技术的进步和成像技术的创新继续推动生命科学的发现边界。我们对组织微结构、细胞和发育生物学的理解通过灌注标记、荧光标记的特异性和光稳定性的改进以及组织清除技术等创新标记方法取得了显著进展。
我们现在有前所未有的能力在细胞和亚细胞水平上研究整个有机体、整个器官和组织。这些技术适用于荧光宽视场，光片和共聚焦显微镜模式，所有这些模式都由广泛的高NA，长工作距离物镜支持，匹配BABB的折射率，Clarity和甘油。
此外，图像分析可以有效地测量感兴趣特征的数量、长度、表面积和体积。然而，当前许多人面临的一个挑战是如何处理、分析和可视化这些随后出现的更大的数据集，这些数据集现在已经从GB迅速增长到TB大小。摘要生物图像信息学是一门快速发展的学科。
参考文献
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