第四届欧洲超分辨率用户俱乐部会议的摘要

基督教Eggeling牛津大学，英国牛津分子医学湿风研究所

脂质 - 脂质和脂质蛋白质膜膜相互作用如脂质纳米瘤的形成（通常表示“筏”）或通过皮质细胞骨架隔室的分子浆膜扩散的限制被认为是在整个膜相关过程中起作用的功能部分。然而，通过常规远场光学显微镜的> 200nm的分辨率极限阻碍了活细胞中这种结构的直接和非侵入性观察。具有卓越的空间分辨率发生的通过在活细胞中使用有效焦点尺寸为20-30纳米的纳米技术，现在可以直接解决这种膜的异质性，例如通过成像和研究膜表面的蛋白质纳米团簇［1］．另一方面，组合发生的纳米镜具有诸如荧光相关光谱（FCS.）允许公开综合纳米镜动力学过程。通过表演FCS.焦点调谐到直径下达30nm的焦点，我们获得了分子膜动力学的新细节。与荧光磷酸甘油脂相比，荧光鞘脂或多种蛋白质瞬时（约10ms）经常胆固醇介导的分子复合物捕获在纳米级上[2]．这些相互作用对于不同的脂质和蛋白质不同，并且可能在蜂窝功能中发挥重要作用[3]．将这些捕获特性与模型膜中不同荧光脂类类似物的组织和动力学进行比较，揭示了脂质“筏”的作用细节。[4]．另一方面，比较不同细胞中脂质和蛋白质的动态，揭示了不同的扩散模式，主要取决于潜在的(肌动蛋白)细胞骨架的组织。此外，通过最近的技术发展，提高了对膜非均质性的认识发生的FCS.方法[5]。新颖的观察揭示了脂质 - 蛋白质相互作用和纳米膜在细胞过程中膜生物活性的作用。将给予感染后免疫细胞的分子过程的实例。

Timo Zimmann，基因组调控中心，先进的光学显微镜，西班牙巴塞罗那

刺激的排放耗尽（发生的）构成一种强大的方法，用于在光学显微镜下的衍射极限之外改进。在具有连续波的系统中检测到的荧光信号的额外时间表（GSTED）（CW.）激光耗尽甚至进一步改善了图像分辨率。

直到最近，门控改进有限CW.-发生的系统到图像的横向分辨率，主要是在频谱的绿色范围内发射的592nm的耗竭。

最近引入了灵活提高轴向分辨率的可能性发生的成像和在660nm下引入耗尽的额外激光线为图像生物样品提供了新的方式。我们已经采取了高度解决的3D堆栈和多通道数据集各种标本和结构，以充分利用使用改进的Z分辨率和橙色对新耗尽激光线的红染料和染料组合的几个项目的这些新功能。

要求取大量的z截面和反褶积的作用进行处理发生的我们将讨论数据集。此外，将给出仅使用592 nm、660 nm的多通道测量的例子，也将给出两个用于耗尽的波长的组合。

Katrin Willig, University of the Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB) Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)， Göttingen, Germany

共聚焦和双光子显微镜是强大的技术成像内部的活细胞，组织或活动物。然而，由于其衍射分辨率有限，仅为光波长的一半(~ 200-350 nm)，因此无法显示细胞的精细细节或亚结构。从目前所有的超分辨率显微镜技术来看，发生的显微镜在组织中的成像能力突出:它是活细胞兼容的，特别是当使用标准荧光蛋白时，它能够记录透明组织内部的3D图像，成像速度比其他超分辨率方法快。

在这里，我们提出了一个应用发生的用显微镜成像活老鼠的大脑结构。突触是神经元之间的接触面，是大脑中最基本的信息处188金宝搏的网址理单元。兴奋性突触大多形成于小的树突，即树突棘。突触的微小大小使它们成为理想的目标发生的显微镜。它表明了发生的显微镜能够在生活有机型脑切片内部的120μm深度成像树枝状斑点，并解决树枝内和刺的肌动蛋白的明显分布［1］．现在我们已经发展了一种直立发生的显微镜通过玻璃窗通过玻璃窗形象的脑皮层，使我们可以观察到视觉皮层的分子层中树突刺的动态[2]．我们在树突棘中发现了丝状肌动蛋白(图1)，树突分枝深度达到40 μm[3]．延时录制显示〜60nm的分辨率的动态变化。

这些结果表明发生的纳米技术是一种非常适合神经科学研究的工具，在活体大脑的研究中可以发挥重要作用。这些结果表明发生的纳米技术是一种非常适合神经科学研究的工具，在活体大脑的研究中可以发挥重要作用。

Nahidi Azar L, Leyton-Puig D, van den Broek B, Klarenbeek J, Manders E, Jalink K, van Leeuwenhoek高级显微镜中心，荷兰癌症研究所，阿姆斯特丹，荷兰

几个世纪以来，光学显微镜在生物学和药物中发挥了关键作用。在没有观察细胞和组织的能力，研究它们的形态，动力学和分子组成，我们只有一小部分我们今天的生活理解。然而，直到最近，我们未能决议遵守建筑物块，因为光学显微镜的分辨率约为50倍。超分辨率显微镜正在快速改变。我们使用地面耗竭成像来研究细胞骨架的组成和破译信号转导机构。

作为第一步，我们已经投资于优化准备和记录条件。已经优化了闪烁条件，并且开发了算法用于漂移校正和背景减法。我们目前正在在许多生物学研究中申请SR GSD。与我所研究所的Sonnenberg实验室合作，我们专注于血渍胚胎的结构，皮肤内的粘合结构。我们还与德国亚琛Reinhard Windhoffer博士合作研究角蛋白灯丝形成和可塑性。在我的谈话中，我讨论了图像优化，提供了用系统获得的新见解的例子，并且还讨论了由于超级分辨率而弹出的新问题。

Marko Lampe, EMBL，先进光学显微镜设备，海德堡，德国

超分辨率荧光显微镜有潜力为细胞和结构生物学提供新的见解。的实现GSDIM和发生的超分辨率显微镜进入EMBL先进光学显微镜设备(ALMF)，与现有技术的相互作用和当前的科学项目的例子将在本次演讲中介绍。2011年，徕卡SR GSD使用GSDIM/Dstorm.安装在ALMF中，并成功地应用于Jan Ellenberg实验室的Anna Szymborska的核毛孔结构［1］．该设施推出了3D SR成像到他们的成像发生的和GSDIM系统在2013年，这不仅增加了显微镜的潜力，也要求精确的样品制备。因此，简要介绍和比较了当前的样品制备程序:在设备中典型的成像工作流程的背景下，也作为一个可能导致光学畸变的因素。

选择合适的技术发生的或GSDIM- 沿着其各自的优点和局限性对于随后的项目成功至关重要，并且将沿着最近的示例从用户和成员的成员讨论。

Mark Neil，帝国理工学院物理系，自然科学系，光子学集团，伦敦，英国

的性能发生的显微镜高度依赖于抑制激发点扩散功能的外部部分的耗尽束的形状和保真度，以允许超级分辨成像。固定相掩模可用于帮助塑造耗尽束，但是不能容纳其形状的变化，以改变操作模式或由于像差的结果。空间光调制器（SLM）提供动态改变直接计算机控制下耗尽光束的瞳孔平面相位的能力，因此是固定相位掩模的灵活和强大的替代方案。

基于液晶SLM呈现光束生成系统，其中通过将适当的耗尽光束复用到非连贯的正交偏振状态，可以同时实现横向和轴向分辨率增强。虽然SLM是连续相位装置，但是通过显示全息图来实现进一步的精度，以便产生适当的相位调制。此外，可以编程全息图以考虑显微镜中的光学像差，由系统本身或在样品中引入。

使用显微镜来提出结果，以通过自然杀伤细胞检查其他细胞进行感染或功能障碍时形成的免疫突触。在传统的载玻片制备中，这些突触倾向于在平行于显微镜轴线定向的平面中形成，因此能够实现横向和轴向分辨率的增强对于突触内的成像结构是重要的。

在另一个应用中，氮空位颜色中心被成像，作为合成钻石和天然钻石差异研究的一部分。在这种情况下，钻石的高折射率即使只聚焦在表面以下几微米，也会引起大量的球差。我们证明了损耗光束产生的畸变可以被纠正，分辨率的增强可以被恢复。

Sergi Padilla-Parra，牛津大学，惠康信托中心人类遗传中心，英国牛津结构生物学分工

选择右荧光蛋白（FP）在在活细胞中设计定量显微镜实验时至关重要。不同的方法需要不同的FP，特定且良好的表征物理化学特性。采摘和克隆不同的FP适合满足特定显微镜技术的需要可能是耗时和繁琐的。FP Engineering最近的进展允许科学家在各种各样的FP中选择，所有这些都与他们的优缺点。由于488和561nm激光线几乎是几乎所有显微镜和技术的常见选择，因此我们推理特定的绿色/红色FP对在活细胞的背景下的定量荧光成像显微镜中的许多方法可能足够灵活。在分析许多绿色/红色FPS之后，我们发现三叶草（MCLOVER）和MRUBY的单体版本是在许多显微镜技术中定量使用的好候选者。光诱导的暗状态（三重态），内在的黑暗状态，光稳定性，它们的荧光衰减的单指数行为和高亮度使这对夫妇成为非常有吸引力和灵活的选择烦恼-fl那FCCS.、双颜色Tirf.显微镜和Dstorm.活细胞的超分辨率。