第五届欧洲超分辨率用户俱乐部会议摘要

Kees Jalink，荷兰癌症研究所，阿姆斯特丹，荷兰

几个世纪以来，光学显微镜在生物学和医学中发挥了关键作用。如果没有观察细胞和组织、研究它们的形态、动态和分子组成的能力，我们对生命的理解就只有今天的一小部分。然而，直到最近，我们还没有足够的分辨率来观察生命的组成部分，因为光学显微镜的分辨率太低了50倍。超分辨率显微镜正在迅速改变这一点。我们使用基态耗尽成像来研究细胞骨架的组成，并破译信号转导机制。

作为第一步，我们已经投资优化准备和记录条件。优化了闪烁条件，开发了漂移校正和背景减影算法。我们目前正将SR-GSD应用于一些生物学研究。在与我们研究所的Sonnenberg实验室的合作中，我们专注于半脂质粒的结构，皮肤内的粘附结构。我们还与德国亚琛的Reinhard Windhoffer博士合作研究角蛋白丝的形成和可塑性。在我的演讲中，我将向你们介绍我们实验室的最新进展，并着重于我认为在不远的将来，定位显微镜的重要方向。

Luca Lanzanó，意大利理工学院，意大利热那亚

细胞内纳米级的可视化已经成为分子生物学的基本需求。目前发展起来的大多数超分辨率荧光方法都是通过在光学可分辨态之间瞬态切换荧光团来提供亚衍射分辨率。因此，不同的超分辨率概念被广泛地分为随机和目标切换方法，根据如何操纵荧光团的状态［1］．然而，亚衍射分辨率也可以通过一种非常不同的策略获得:通过将空间信息编码到时间通道中，并在通过显微镜设置传输后解码它［2］. 显微镜检测体积内分子的纳米级空间分布可在荧光动力学中编码，并可通过将信号分解为其动力学分量来解码。因此，提高光学显微镜空间分辨率的挑战转化为将信号分解为其动力学分量的光谱学任务。本文提出了一种基于相关分子动力学对荧光光子进行空间排序的鲁棒通用方法［3］. 在该方法中，无需任何使用相量分析的拟合程序即可获得动力学分量的分离［4］．在具体实施方案中，我们考虑通过刺激发射产生的荧光寿命中的梯度CW.-受激发射损耗显微镜［5］. 我们表明，空间分辨率可以通过将分辨率分量的数量增加到一个最大的、可预测的数量（由噪声量决定）来无限期地增加。有趣的是，该方法还分离出任何不相关的背景信号。我们证明，这种基于光谱的方法提供了亚细胞结构的无背景纳米级成像，开辟了基于通过操纵分子动力学编码空间信息的超分辨率显微镜的新途径［3］．

Imre Gaspar，发展生物学单位，EMBL，海德堡，德国

在绝大多数被研究的动物物种中，体轴已经在卵发生过程中通过信使RNA分子的定位和定位翻译确定。这些mrna通常-但不限于-在其3 '非翻译区域包含特定的结构(顺式作用元件)，并招募特定的蛋白质分子(反式作用元件)，从而形成功能性核糖核蛋白复合物(mRNPs)。［1］．然而，mRNPs的组成从翻译到衰变是动态变化的［1］高时空分辨率的显微技术对mRNP生物发生研究具有重要价值。

在果蝇的卵发生过程中，oskar mRNPs在护理细胞中合成，然后通过细胞质动力蛋白转运到相互连接的卵母细胞中。在卵母细胞中，oskar mRNA最初定位于后极，在卵发生中期依赖于激肽-1［2］. 为了了解具有转运和定位能力的oskar MRNP的形成，我们选择了一种基于候选的共定位分析方法，使用共焦和共聚焦技术受激发射损耗显微镜。为了使特异性最大化并使标记的距离最小化为oskar mRNA，我们使用噻唑橙（FIT）探针的强制插入，只会在与目标结合时荧光［3］．FIT探针允许进行“温和”的原位杂交，保留了自荧光绿色荧光蛋白标记的蛋白质。此外，虽然TO的发射和激发光谱有足够的不同(红移)绿色荧光蛋白为了获得穿透血流的自由图像，可以用592 nm激发其发射，而不需要任何再激发。

我们发现Oskar MRNP与Kinesin-1助理，但在出口到护士细胞细胞质后没有用Dynein。有趣的是，与Kinesin-1的关系需要由Dtropomyosin1基因编码的非典型对杂蛋白蛋白，并且还剪切Oskar mRNA的第一个内含子［4］．

Luc Reymond、实验室的蛋白质工程、瑞士洛桑联邦理工

理想的超分辨率成像荧光探针是明亮的、长波吸收的，可以灵活地在活细胞和体内实现。然而，结合所有这些特性的合成探针的设计已经被证明是极其困难的。在这里，我们介绍了一套基于硅罗丹明的探针，结合了远红外发射，荧光性，最小的细胞毒性，优异的亮度和光稳定性，用于活细胞的细胞结构的荧光成像。应用于受激发射耗竭(受激发射损耗)，它们可以以前所未有的分辨率成像活细胞中的细胞结构。本文将介绍这些探针的发展现状及其在活细胞成像中的应用。

Leila Nahidi Azar，荷兰癌症研究所，阿姆斯特丹，荷兰

半桥粒已被免疫荧光显微镜广泛研究，但由于其分辨率有限，半桥粒的精确结构仍知之甚少。我们通过高度校正的2色和3色超分辨显微镜研究了培养角质形成细胞中的半桥粒组织。我们观察到，在细胞周围，新生的半桥粒与个别的角蛋白丝有关。通过量化分子距离，我们证明了连接蛋白BP230和plectin都与角蛋白不对称相互作用。此外，我们还发现BP180和BP230在这些半桥粒内具有特征性排列，BP180分子围绕着BP230分子的中心核心。在我的演讲中，我将强调如何开发新的图像分析方法，以取代对SR成像价值有限的概念，如共定位。

罗伯特•Nieuwenhuizen代尔夫特理工大学，影像物理系，荷兰代尔夫特定量成像集团

细胞骨架蛋白网络在活细胞中起着重要的作用。为了理解不同的灯丝网络是如何相互作用和协作来执行这些功能的，重要的是了解这些网络的纳米尺度空间安排。现在，超分辨率显微镜技术使分辨这些网络成为可能。这就需要新的定量工具来询问不同细胞骨架元素之间的组织和相互关系。

我们提出了一种新的定量框架，其中我们确定长丝的定向对准如何影响其分层化（通过对互相关函数测量）。长丝的同时取向对准和分层化将被称为共定位。我们展示了通过Ripley K系数的各向异性概括来局部地定量局部的强度如何定量，我们提出了统计学意义的测试。我们展示了我们关于丝结构的模拟定位显微镜数据的方法，以及多色GSDIM丝状结构的图像。

Daniela Leyton Puig，曼彻斯特大学曼彻斯特炎症研究合作中心，英国曼彻斯特

细胞表面受体将信息从细胞外信使分子传递到细胞内部。激活后，许多受体可以迅速形成小簇，在大多数情况下，最终被细胞内化。已知一些受体类型继续在细胞内发出信号，但对大多数受体来说，内在化使它们与第二信使级联分离。我研究了受体聚类和细胞用网格蛋白介导的受体摄取GSDIM．在一般的介绍之后，我将描述我的实验和理论工作，旨在定量受体在质膜聚集。

大卫·威廉姆森曼彻斯特大学曼彻斯特炎症研究合作中心，英国曼彻斯特

与传统的基于像素的显微镜图像相比，单分子定位显微镜（SMLM）图像具有独特的挑战。已经涉及用于生成SMLM图像的方法和算法的工作。然而，对来自这些图像的有用信息的随后提取和解释的重点较小，但这是这些数据对于从SMLM图像绘制生物学有意义的结论至关重要。

在这里，我们展示了关于血浆膜中蛋白质的空间排列的信息如何通过检查不同尺度的分子密度，正式描述的Ripley的K函数和相关的Getis＆Franklin的L功能正常地定量。这些方法延长以提供高分辨率和3D图像的不同蛋白质的“共聚类”的信息。目前正在开发的新型方法利用分子的N个最近邻居的距离来导出“聚类”值，并避免其他聚类方法中固有的一些问题。

Jonas Ries, CBB, EMBL，海德堡，德国

基于单分子定位的超分辨率显微镜(SMLM)目前已经达到了足够的分辨率来确定细胞内蛋白质组装的结构。因此，它是对经典结构技术(如x射线晶体学或电子显微镜)的一种补充技术，用于研究分子机器是如何组织的。

在这次演讲中，我将介绍一种新的各向同性3D SMLM方法，我将介绍两种SMLM标记方案，并报告我们在解决纳米尺度上的基本多蛋白机制方面的进展，即酿酒酵母的内吞机制。

超临界角度定位显微技术(SALM)是一种基于表面产生荧光原理的三维SMLM技术。

这种近场荧光强烈依赖于荧光团与覆盖层的距离，因此可以用来估计它们的轴向位置。我们建立了一个稳健而简单的实现超临界角度荧光检测单分子定位显微镜，用荧光珠样品校准，用DNA折纸四面体验证该方法，并提供生物样品的原理证明数据。

定位显微镜需要用明亮和可切换的染料进行高度标记。然而，到目前为止，这需要克隆特殊的荧光蛋白或产生高亲和性抗体来进行特殊标记。另一方面，许多实验室将把他们的大部分构造放在绿色荧光蛋白形式和整个基因组可作为功能基因组使用绿色荧光蛋白融合蛋白。

在这里，我们报告了一种方法，使所有这些构造通过靶向通过靶向显微镜绿色荧光蛋白微小的高亲和力抗体与闪烁的染料结合。因此，它结合了遗传标记的分子特异性与有机染料的高光子产量和最小的连锁误差。我们结合绿色荧光蛋白-实际上，任何已知的蛋白质都可以立即用于超分辨率显微镜，并且使用简化的标记方案进行高通量超分辨率成像是可能的。

作为一种可光开关荧光团的替代方法，我们引入了结合激活定位显微镜(BALM)，它利用荧光染料结合到目标结构上的荧光增强来实现超分辨率显微镜。

我们使用这种方法来研究DNA结构和a-突触蛋白淀粉样蛋白，可以显示出极好的标记密度和非常高的分辨率。

内吞作用是一个高度复杂的细胞过程，在酵母中涉及到大约60个蛋白质的有序招募和分解。我们目前的工作重点是了解分离前的中后期涂层组装。在这里，我们能够揭示关于内吞外壳蛋白的形状和结构的亚衍射特征，这是以前无法获得的。通过双色超分辨率显微镜观察许多蛋白质对，我们正在努力获得内吞蛋白质组的全面结构图。

Jürgen J. Schmied，德国不伦瑞格工业大学

由于突破衍射极限的新技术的出现，荧光显微镜领域在分辨率方面取得了巨大的进步，总结为超分辨率显微镜。现在，分辨率可以达到20纳米或更低，但由于缺乏精确和纳米尺度的荧光标准，验证和测试这些超分辨率显微镜仍然具有挑战性。自上而下和自下而上技术之间的差距——从几纳米到几百纳米不等——可以通过DNA纳米技术来弥补，它允许特定地设计具有程序化形状和功能的分子结构。这种技术被称为DNA折纸技术，它可以精确地将荧光染料附着在预先指定的位置，并随后确定荧光团的点对点距离[1,2]．基于DNA折纸的显微镜标准设计的灵活性和多功能性使它们非常适合各种新兴的超分辨率显微镜方法。由于DNA“折纸”结构的耐用性和便携性，它们可以成为一种普遍可用的标本，用于检查显微镜的日常功能。例如，纳米尺能够以统计可靠和可重复的方式定量测定分辨率，并允许对不同超分辨率技术的分辨率进行比较。标尺是为不同的应用而开发的，例如受激发射损耗和SIM以及2D和3D中基于定位的超分辨率显微镜。

伊万·米歇尔·安托洛维奇，代尔夫特理工大学",微电子学的部门,荷兰代尔夫特电路与系统公司

定位超分辨率显微术(GSDIM，风暴，以及其他技术)的基础是准确地确定单个荧光团稀疏激活点扩散功能的中心。由于探测到的光子的数量决定了图像分辨率，由于其高量子效率和内置电子放大，首选的相机是emccd。

或者，单光子雪崩二极管（SPAD）成像仪可以提供更快的帧速率和零读出噪声。我们使用了一个名为SwissSPAD的1位512×128 SPAD成像仪，它支持6.4μs的帧[1]。1位帧的可变序列可用于形成可编程分辨率的灰度图像，同时保持相同的时间分辨率信息。使用直接安装在传感器上的微透镜阵列，成像仪的灵敏度（以光子探测效率（PDE）为特征）提高了12倍[2]。

我们用SwissSpad测量了多色强度繁荣，并将其性能与商业EMCCD相机进行了比较。此外，更高的灵敏度使我们能够根据需要检测单个荧光团GSDIM6.4 μs的时间分辨率使得分析荧光团在每个像素上独立的闪烁效应达到了前所未有的精度。