本地化显微镜
普通荧光显微镜图像的分辨率受衍射限制，约为发射光波长的一半。为了分离荧光标记的更紧密的结构，需要克服阿贝衍射极限的解决方案。超过衍射极限的最常见的超分辨率成像方法是定位显微镜、SIM(结构照明)和发生的(受激发射损耗显微镜)。
基态耗尽，然后单个分子返回(GSDIM)是一种定位显微技术。一般来说，定位显微镜并不观察同时发射荧光团的整体，而是观察明显分离的、可以以纳米级精度定位的单个荧光团。随着时间的推移，标记生物结构的每个荧光团的位置被确定，并基于每个荧光团的位置信息在硅中重建图像。目前的挑战是如何有效地将一组荧光团奇点化，从而实现对单个分子的检测。
GSDIM——分子基础
关键的一步GSDIM是暂时关闭大多数荧光团，以允许单个荧光团的精确定位。为此，高强度激发光的使用使得样品中几乎所有的荧光团都变暗，只留下一个分离良好的荧光团发出荧光，这是实现纳米精度定位的先决条件。
图1(右):结构示意图GSDIM基于简化雅布隆斯基图的方法。例如，荧光团中的离域π电子可以处于基态S0>，激发态S1(都是所谓的ON状态)或处于三重或自由基暗状态(都是OFF状态)。当荧光灯发出时，电子在基态和激发态之间循环。与这些ON状态不同，处于OFF状态的荧光团不能发光。这些OFF状态通常有很长的生命周期，但是它们很难获得，因为需要系统间的交叉。通过在包埋介质中设置适当的环境条件，并通过聪明地选择用于免疫荧光的标准荧光团，可以通过极端光照强度激发荧光团来可逆地关闭荧光团。当有足够的分子处于OFF状态时，就可以检测样品中的单个分子。
分子态间跃迁
当荧光样品被(激光)光激发时，电子被光子弹射到第一激发态。当从第一态返回到基态时，能量稍低的光(红移)被发射出来。更高的激光功率增加了能击中基态电子并将电子转移到激发态的光子数量。结果是，在给定的时间内，基态和激发态之间的样品循环中有更多的电子。发射出来的光子数量增加，就能看到更亮的样本。
进一步增加激发光(例如来自高功率激光源)会由于荧光发射降低导致样品变暗。在这个过程的开始，激发光的增加导致更多的电子在基态和第一激发态之间循环。从激发态有一定比例的电子进入关闭态。从第一激发态唯一可达的子态是三重态。进入三重态需要电子的自旋翻转。自旋翻转发生的概率很低，因此是非常罕见的事件。因此，在样品的低光照射下，关闭状态几乎是不存在的。
关态具有较长的寿命(在μs到s的范围内)，电子处于关态的荧光团不再参与样品的荧光发射。随着时间的推移，越来越多的电子最终处于关闭状态，样品看起来更暗，尽管荧光团的总数量没有改变。仅仅是“活跃的”或“可接触的”荧光团的数量被改变了。“泵送”处于关闭状态的电子可以看作是一个可逆开关。当电子停留在关闭状态时，荧光团被关闭。当电子返回基态时，荧光团变得“有活性”，并能再次发出荧光灯。电子分子态之间的所有跃迁都是受概率控制的过程，因此对于给定的电子来说，跃迁的确切发生是无法预测的。
定位精度达到纳米级
对于超分辨率成像，激光功率保持在高水平，直到视野中只有少数荧光团发射光子。“活性”荧光团可以在基态和第一激发态之间循环几千次，在电子返回到关闭态之前产生光子“爆发”。光子“爆发”被高灵敏度的EMCCD相机记录下来。此外，只有少数电子在短时间内填充基态，导致“单个分子返回基态耗尽”的情况(GSDIM）.一般来说，发射光子爆发的荧光团在空间上是分开的，这允许在某个区域的所有光子分配到单个分子。在这种情况下，记录的衍射限制信号的中心与荧光团的位置相同。荧光团的位置可以精确到纳米级。
图3(右):宽场与GSDIM．高尔基膜蛋白Giantin和高尔基基质蛋白GM130，分别用Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488免疫荧光染色。日本东京大学医学研究生院细胞生物学与解剖学系冈田康博士提供。
为什么有机荧光团更好
超分辨率图像的最终分辨率取决于a)每个单个荧光团的定位精度(定位精度)和b)标记感兴趣结构的单个荧光团之间的最小距离(染色密度)。染色密度可能受到影响，例如免疫染色时使用的较高抗体浓度。定位精度取决于从单个荧光团收集到的光子数，可以用以下公式近似:
Δr:显微镜/物镜的衍射极限
N:单个定域荧光团发出的光子数
Δ短信:单个荧光团的定位精度
因此，为了实现10 nm的定位精度，必须用衍射有限分辨率为200 nm的显微镜从荧光团中收集400光子。在第一个实例中，所发射的光子数是所述荧光团与所述嵌入介质结合的特性。一般来说，有机荧光团比荧光蛋白显示更高的亮度和光稳定性。因此，这些染料传递的光子数量要高得多，定位精度也大大提高。最后，由于提高了定位精度，有机荧光团等“更强”的染料可以获得更好的超分辨率图像!
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