通过引入抗体介导的免疫组织化学染色和基于DNA杂交的染色来启动特定染色的革命。这些允许单一蛋白质或DNA序列突出显示在化学上类似的分子的巨大背景中，这些分子不能与典型的化学染料分化。在这种情况下的最新进展已经用荧光蛋白质进行。这些被引入染色结构，分子和细胞，或者用于在活细胞和生物中的代谢物，离子和其他物种的传感器中用于，以提供用于在实时模式下观察生命机械的窗口。然而，所有这些染色程序都涉及或多或少的侵入性干预，并且在许多情况下需要死亡或固定制剂。另外，荧光蛋白质方法取决于靶细胞中的外来蛋白质的表达，这些细胞通常会显着干扰细胞中的敏感调节的稳态。因此，探讨了方法，允许在没有任何染色的情况下造成庞大样品的成像。
图1:左图:两段三明治酱记录的叠加图像:红色显示脂质，绿色显示水，25倍物镜，比例尺25 μm。右图:不同类型巨噬细胞中脂质积累的定位和级别的研究:红色为脂质，绿色为肌动蛋白，63倍物象。感谢:Alba Alfonso Garcia和Jeff Suhalim, Potma实验室，美国加州大学。细胞:Dr. Adelheid Kratzer，科罗拉多大学内科肺和重症监护室。
瑞利和拉曼散射
光可以不仅通过吸收光子之后的光子，而不是假设较高的激励状态，而且还通过假设所谓的“虚拟状态”来相互作用。在这种情况下，光子不具有能量的量，其将适合给定分子中的任何状态差异。因此，释放的光子不是震动移位，因为在可能导致发射到红色的虚拟状态下没有热成分序列（在荧光中，激发状态将首先快速地放松到最低振动的变电站激发状态，释放留下发射光子的热能 - 较少的能量 - Redder音调）。在正常散射条件下，因此入射和散射光子因此具有相同的能量，其是相同的颜色，并且不能从相互作用分子中携带任何特定信息。该标准案例称为“瑞利散射”（图2：Y）。
尽管如此，发射不覆盖到分子的最低振动状态的排放不覆盖，但是，例如，能量仅返回到第一热状态。在这种情况下，发射的光子仅缺乏该热状态的能量差到接地状态。排放是红移的。这种现象称为拉曼散射（这里，Stokes散射，见下文，以替代，图2：s）。随着这些子种聚合物的能量差异对于分子结构非常具体，事件和释放光子之间的能量差揭示了与光相互作用的化合物的细节。因此，拉曼光谱在分析化学中成为一个非常有用的工具。或者，分子可能恰好驻留在振动状态（即使在环境温度下也会发生一些程度）。在这种情况下，与上面讨论的示例相比，照明时的虚拟状态更高。由于分子通常呈现发射后的最低能量，散射光子具有比入射光仪更高的能量。这被称为反斯托克斯散射（图2：a）。 Both processes occur very rarely; the Stokes process some 10-3-10-4时间不到瑞利工艺，而反斯托克斯的过程甚至是下面的一个或两个订单。对于成像，自发拉曼散射的效率远远太低，不能在合理的时间内产生足够的信号。
扩增反斯托克斯拉曼信号
为了产生拉曼光子的有用强度，有必要人为地增加第一振动状态的群体。当实现这一点时，许多光子将在反斯托克斯波长下发射，并且产生可测量的信号。
为了实现这一目标，使用标准高功率脉冲将一束强烈的红外光束(泵浦光)初始聚焦到样品中IR.激光。该光束将在分子的集合中促进许多虚拟状态。为避免返回零振动水平，施加第二梁（探测光束），刺激从虚拟状态的返回，就像a发生的使激发态返回基态的光束。如果第二束被调谐到与第一振动态完全匹配(这意味着能量必须是泵浦光和振动能的差值)，那么分子在基态就不会假定为零能级。因此，焦点中的许多分子被促进到振动状态。第二个激光器是可调的IR.激光和现代系统都使用一种复合装置，这种装置可以同轴地提供两种波长。
这两个过程或多或少同时发生。两个波长都需要照亮样品。因此，当泵浦光仍处于开启状态时，分子可以从第一振动基态开始，假定一个更高的虚态。它们将从这个虚态放松到基态的零次态，从而发射出比泵浦光能量更高的光子。这个差正好是第一热态的能量。我们需要做的就是收集这些散射光并将它们从泵光和探测光束中分离出来。没有必要配合anti-Stokes波长发射带通滤波器,因为特定的信号是由填充大量热状态的特定化合物的问题(图3)。具体的信号是泵和探针之间的区别,必须调整来选择所需的化合物。
我们现在可以看到的东西
由于热能与化学键的关系非常明确，因此可以确定样品中不同类型的键。对比是基于比热激励，信号将与化合物的浓度成比例。CH-CH键高度集中在脂质双分子层和其他非极性结构中。因此，不需要任何荧光染色程序，就可以在极性(大部分为水)背景下成像脂质区域。这已被证明是非常成功的许多类型的样品。整个有机体，如果蝇胚胎、成虫和组织样本、细胞，甚至活酵母细胞，无需任何染色程序就可以看到。与快速扫描系统相结合，例如徕卡的共振扫描仪TCSSP8汽车，细胞内的秘密可以在生理条件下被监测。食品样品可以检测成分的脂-水分布，在聚合物研究和工业中开辟了巨大的应用范围。
荧光显微镜在细胞生物学中起着关键作用，因为它可以通过荧光染料选择性地染色细胞成分。靶向染色的第一批探索者之一保罗·埃利希(Paul Ehrlich)认为，特定染色的东西也应该特定地杀伤——这与“灵丹妙药”(magic bullet)一词有关，这是化疗的基本概念。他的团队发现了Salvarsan，一种专门针对梅毒的药物——尽管还不够具体，不会产生实质性的副作用。筛选许多荧光染料导致了一长列染色，其中用于组织学，包括染料如DAPI或苏木精和伊红。
