上皮细胞的蛋白质转运和极化
极性上皮细胞是一个功能器官的先决条件。它们在器官的外表面形成一层单层，在器官和环境之间提供屏障和交换系统。上皮细胞的极化结构的特点是其质膜上有两个不同的区域，顶端区域面向器官n管腔和基底外侧区，细胞间和细胞外基质发生接触。两个膜区通过紧密连接分离，并显示出不同的蛋白质和脂质成分。为了保持这种极性，上皮细胞进化出一种高度特异的蛋白质和脂质极化分类，以到达其目标膜.188金宝搏的网址
顶端蛋白的分选需要不同的分选信号，通过不同的途径到达细胞表面。GPI(糖基磷脂酰肌醇)锚以及N-和o -聚糖的参与被认为是顶端分选信号。根据转运蛋白与脂筏的亲和程度，可以对分选途径进行细分。因此，存在脂筏依赖性和非依赖性途径。因此，蛋白质在反式高尔基网络(trans-Golgi network, TGN)或后高尔基室被分离成不同的囊泡种群[1]．
分拣过程涉及许多蛋白质，这些蛋白质是正确运送货物蛋白质所必需的。一个重要的分拣受体是半乳糖凝集素-3。半乳糖凝集素-3可通过糖基化作用与特定货物结合，并导致运输到正确的质膜中［2］此外，肌动蛋白微丝和微管形成的细胞骨架轨迹通过分泌囊泡和细胞器的运动参与这一过程。微管尤其是细胞内长通道所需的微管。微管由聚合成二聚体的α-和β-微管蛋白亚基组成酪氨酸化-微管蛋白的去酪氨酸化，即从α-微管蛋白的C-末端结构域添加或去除酪氨酸残基，是将货物正确输送至顶膜所必需的［3］．
高度决断GSDIM图像描绘了这些修饰沿着单个分子的分布，并可以详细解析参与极化蛋白质运输的细胞成分。
3D GSD原理
衍射屏障将常规光学显微镜的成像分辨率限制在横向尺寸为200–300 nm，轴向尺寸为500–800 nm，使许多细胞内的细胞器和结构无法溶解。许多细胞结构要小得多，例如高尔基体的池像煎饼一样排列，间距<100 nm，线粒体内膜中的ATP合成酶间距为10 nm，微管由二聚化亚单位组成，形成外径为25 nm的空心杆。通过超分辨率显微镜技术，如受激发射损耗，已经使用了几种方法来克服二维衍射极限(受激发射损耗)显微术，光活化定位显微术(棕榈)、随机光学重建显微术(风暴)基态耗尽，然后是单个分子返回(GSDIM)显微镜检查。直接随机光学重建显微镜可以分辨细胞室的三维结构(dSTORM)和最近的3DGSDIM显微镜（徕卡SR GSD 3D）。
在dSTORM和GSDIM在显微镜学中，确定一个荧光色素的确切位置是基于时间分离的原理。这需要在开和关状态之间切换荧光色，然后进行顺序读数。在实验开始时，大多数荧光色素通过应用高强度激光进入长寿命暗状态(OFF状态)。只有单个分子会随机返回到ON状态，并在返回到黑暗状态之前短时间发出荧光。这些分子发出的荧光信号在从暗到亮再回到暗的过程中被记录下来。最后，从数千幅图像中重建出超分辨率图像［4］．
荧光信号将被描述为几百纳米大小的点扩散函数（PSF）。但PSF可以通过二维高斯函数进行调整/调整，以定位分子的准确位置。分子位置的精度取决于信号强度，即收集的光子数［5］。通过检测彼此暂时分离的单个荧光点，可提高分辨率。
为了使单个荧光团在z方向上定位，通过在显微镜的成像路径中引入圆柱形透镜，利用了散光效应。因此，荧光斑的椭圆度和方向随其在z维中的位置而变化，从而实现了三维重建。当荧光团位于焦平面时，图像呈圆形。当荧光团位于焦点下方时，像斑形状在垂直方向拉长，而当荧光团高于焦点位置时，像斑形状在水平方向拉长[6]。
徕卡SR GSD 3D系统的高功率激光可以切换大范围的荧光染料，并可以在短时间内收集许多光子，使研究人员能够使用荧光抗体和Alexa染料，这些荧光抗体和染料也可用于传统的表观荧光。高功率激光物镜的放大倍数为160倍，有助于以高分辨率精确定位单个分子。为了达到这种精度，需要延长时间。通过SuMo（抑制运动）工作台技术实现了在整个成像周期内不漂移样品的先决条件，该技术将横向漂移降至20 nm/10 min以下。
三维可视化的细胞物流隔间
Leica SR GSD 3D系统是定位显微镜中的一种新方法，用于在三维高分辨率显示细胞间隔。为了了解极化上皮细胞中的转运过程，需要精确定位参与蛋白质运输的不同细胞器。使用高分辨率GSD显微镜复制可以分析高尔基体基质蛋白gm130、线粒体ATP合酶ATP-2B和脱酪氨酸微管（脱酪氨酸微管蛋白）。在盖玻片上培养一天的MDCK野生型细胞用冰冷甲醇或4%PFA固定。用1%奶粉或PBS+中的1%BSA（牛血清白蛋白）封闭细胞（PBS与1 mM CaCl2和1毫米氯化镁2)使用针对gm130、ATP-2B或detyr微管蛋白的抗体进行免疫染色。然后使用PBS中的100 mM MEA（β-巯基乙胺）作为包埋介质，用Alexa647偶联抗体标记初级抗体。高尔基体由gm130的圆形结构标记，该结构以超分辨率面向高尔基体腔（图2A）。除了2D图像与Epifluorescent图像相比的详细信息外，第三维度使用颜色梯度明确定义了该隔室的细胞定位，该颜色梯度指示0–800 nm的z轴。尽管线粒体和微管在2D GSD图像（图2B）中已得到很好的分辨率，但3D GSD超分辨率图像显示了线粒体在微管附近的位置，表明这些细胞器沿着细胞骨架轨迹运动。
一)
B)
图1：宽场显微镜对比，2DGSDIM和3 dGSDIM显微镜。
A） 将MDCK细胞培养在盖玻片上，固定并对高尔基基质蛋白gm130/Alexa647进行免疫染色。比例尺2µm。
B)在覆盖物上生长的MDCK细胞使用抗ATP- 2b抗体固定和染色线粒体ATP合酶和使用抗detyr-tubulin抗体微管。两种抗体均用Alexa647偶联二抗标记。鳞片2µm。颜色梯度表示x轴0-800 nm。
前景
超分辨率GSDIM有助于更详细地阐明参与极化蛋白质运输的组分的定位，从而阐明以前未解决的转运机制。3D GSD图像显示分辨率比传统的表观荧光图像有所提高，此外，它还提供了没有发现的3D信息t由2D图像提供。在3D中使用这种超分辨率技术，将来将有可能监测蛋白质运输途径的更多成分，如运输囊泡本身。徕卡SR GSD 3D是一种新型超分辨率显微镜，具有多应用平台，包括TIRF，宽视场和超分辨率，能够更深入地了解细胞内的基本过程。
工具书类
- Delacour D，Jacob R：顶端蛋白质运输。单间牢房摩尔生命科学。63: 2491–2505 (2006).
- Delacour D, Cramm-Behrens CI, Drobecq H, Le Bivic A, Naim HY, Jacob R:半乳糖凝集素-3在顶端蛋白分类中的需求。咕咕叫。生物学杂志。16:(2006)408-414(2006)。
- Zink S, Grosse L, Freikamp A, Bänfer S, Müksch F, Jacob R:微管蛋白去糖化促进上皮细胞单分子层的形成和顶端运输。中国生物医学工程学报。
- Fölling J, Bossi M, Bock H, Medda R, Wurm CA, Hein B, Jakobs, Eggeling C, Hell SW:基态耗尽和单分子返回的荧光纳米显微镜。自然冰毒5:943-945(2008)。
- Thompson RE, Larson DR, Webb WW:单个荧光探针的精确纳米定位分析。生物物理学报2775-2783(2002)。
- 黄斌，王伟，贝茨·M，庄旭:基于随机光学重建显微技术的三维超分辨率成像。中国科学(d辑:地球科学)。
