简介
微管蛋白是一种在细胞内普遍存在的构成微管的球状蛋白。α-和β-微管蛋白二聚体与GTP结合，并在GTP结合状态下组装到微管的(+)端。与GTP结合的微管蛋白二聚体倾向于组装成微管，而与GDP结合的二聚体倾向于分裂;因此，GTP循环对微管的动态稳定性至关重要。AKT是一种研究充分的细胞内信号蛋白，是agc激酶家族的成员< [2］．AKT具有pleckstrin同源结构域，与膜磷酸肌醇具有高亲和力。这对于控制细胞信号是有用的，因为二磷酸化的磷酸肌醇PtdIns(4,5)P2仅被PI3 -激酶(磷酸肌醇3-激酶或PI3K)家族的酶磷酸化，并且仅在接收到告诉细胞开始生长过程的化学信使后才被磷酸化[3.］．一旦通过与PIP3结合正确定位在膜上，AKT就可以被其激活的激酶磷酸化，磷酸肌醇依赖性激酶1 (PDPK1)磷酸化苏氨酸308或mTORC2磷酸化丝氨酸473。mTORC2磷酸化可刺激AKT随后被PDK1磷酸化。激活的AKT可以通过其激酶活性继续激活或失活无数底物。
徕卡TCS发生的(受激发射耗竭)成像系统是第一种商用共聚焦显微镜，集成了超分辨率，能够研究70 nm分辨率范围以下的结构细节。它的超分辨率能力使成像分辨率比传统共聚焦扫描显微镜高两到三倍[1］无需采集后图像处理。我们使用了两种荧光染料，ATTO 647N和Dylight™488，它们表现出适合于发生的以及常规扫描共聚焦显微镜。这些荧光色素与二抗结合，间接检测微管蛋白微管蛋白和信号转导蛋白AKT，使用微管蛋白特异性抗体和活化的AKT特异性抗体来确定这些靶点在静息和活化的A431细胞中的亚细胞时间定位。
方法
条件发生的纳米:A431细胞(ATCC CRL-1555)在37°C和5% CO孵育2DMEM (Invitrogen, MO)中含有10%胎牛血清(Rockland, PA)和Pen链球菌(Invitrogen, USA)， 75厘米2康宁CellBind细胞培养瓶(Sigma, MO)，除非另有说明。在80%到70融合细胞分离使用TrypLE(表达载体、钼),然后放在# 1.5鼠标层粘连蛋白涂盖玻片在6孔板和孵化DMEM /的边后卫/笔喉炎的症状1 h RT,一旦连接,手机媒体取代DMEM没有的边后卫(血清饥饿)和孵化15 h。细胞要么是直接用4%多聚甲醛固定为5分钟(PAF)参谋长RT,或孵化DMEM和100 ng / ml的表皮生长因子(微孔,MA) 10、15日20或120分钟。细胞经4%冷PAF处理后固定。固定细胞在RT时用PBS冲洗，然后在PBS/ 10%正常山羊血清/ 0.2% Triton-X100中孵育以阻断细胞。
细胞用一抗小鼠抗akt pS473 (p/n 200-301-268, Rockland, PA)在20 μg/ml的阻断液中孵育1 h。将细胞在PBS中冲洗两次15分钟，然后在封闭液中孵育30分钟。将ATTO 647N抗小鼠IgG在封闭液中1:1:10 00稀释，与细胞反应1小时。PBS洗涤后，用1:1:10 00稀释的α-微管蛋白孵育1小时，然后按照上述方法洗涤和再次封闭。然后以1 μg/mL的浓度加入DyLight™488山羊抗兔IgG (p/n 611-141-122，宾夕法尼亚州罗克兰)1小时。在PBS中最后清洗后，盖片用水冲洗，并在2-2 '硫代乙醇(TDE)中以97%的浓度安装。
这些幻灯片是用徕卡相机检查的TCS发生的成像系统使用640 nm脉冲激光激发ATTO 647N荧光和Ti-Sapphire红外多光子激光调谐到750 nm作为耗尽激光检测ATTO染料发生的模式。DyLight™488染料使用可见氩488 nm激光与ATTO 647N同时或顺序检测。
结果
AKT活化和迁移的评价发生的nanoscopy
用共聚焦显微镜低分辨率检测AKT定位的变化。莱卡TCS用SP5检测微管蛋白(青色)，用DyLight™488山羊抗兔IgG检测的PAb抗微管蛋白激活AKT(红色)，用ATTO 647N山羊抗小鼠IgG检测的MAb抗AKT pS473。图1中的图像显示，AKT在血清饥饿静止细胞中呈弱弥散染色，AKT在有丝分裂原EGF刺激下被激活并迁移到细胞外围15分钟。
图1:EGF处理A431细胞的共聚焦显微镜观察
AKT活化和迁移的评价发生的nanoscopy
对A431细胞进行血清饥饿和EGF处理以激活AKT。图2，面板A所示发生的图像(AKT p473抗体，红色通道)与未受刺激的血清饥饿细胞的共聚焦图像(微管蛋白抗体，绿色通道)同时采集。面板B-E显示发生的分别用EGF刺激A431细胞10、15、20和120分钟。箭头表示在高倍放大时显示的区域(下面板)。缺乏血清的细胞显示高度组织的微管，含有微管蛋白和少量活化的AKT，主要出现在细胞外围。EGF刺激细胞后，AKT被快速激活(面板罪犯)和微管组织的同步变化，以及细胞形状的广泛变化也被注意到。后者在B图中很明显，显示有相当多的膜折叠的细胞。
图B、C和D显示磷酸化的AKT pS473在细胞外围聚集。C图显示AKTpS473强度信号变化最大，在15 min出现激活峰值，与解聚微管蛋白共定位(黄色信号)。D图显示，EGF刺激20分钟后，磷酸化的AKT和微管蛋白共定位局限于细胞外周，似乎与新表达的伪filipodia有关。然而，与15分钟刺激相比，20分钟后磷酸化的AKTpS473水平显著降低。在EGF刺激120分钟后(E图)，磷酸化的AKT pS473水平与未刺激的细胞相当，然而，微管似乎没有重新组装或聚合。
图2:AKT活化和迁移的评估发生的nanoscopy
发生的与共焦分辨率比较
图3左面板A(绿色)所示的结构显示了共聚焦显微镜无法分辨的颗粒。在面板B中，结构被区分并显示为4个不同的粒子发生的模式(红色)。在C和D图中，我们显示了EGF刺激后10分钟，AKT结构的分辨率为62 nm (D图)。在EGF刺激20分钟后，观察到AKT颗粒尺寸达到300 nm或更大。
图3:发生的与共焦分辨率比较
A431细胞中EGFR通路的刺激导致AKT的激活
Western blotting与荧光显微镜同时进行，以验证AKT的活化。对A431全细胞裂解物进行Western blotting。对A431细胞进行未刺激(-)或EGF(+)刺激15 min以激活EGF受体(EGFR)。所有试剂均来自Rockland (Gilbertsville, PA)。印迹用荧光蛋白印迹的阻挡缓冲液(p/n MB-070)进行阻挡。
印迹A:培养抗hEGFR的一抗(p/n 100-401-149)和活化的hEGFR pY1197 (p/n 600-401-928)，并用DyLight™549 (p/n 611-142-122)(红色)或DyLight™649 (p/n 611-143-122)(绿色)偶联山羊抗兔IgG检测。在这个实验中，我们发现磷酸化的hEGFR只存在于EGF刺激的细胞中。Blot B:用DyLight™549 Goat anti-Rabbit IgG(蓝色)检测抗α-Tubulin的一抗(p/n 600-401-880)。抗AKT pS473的单克隆抗体直接偶联到DyLight™649 (p/n 200-343-268)(红色)。在这张图中，我们发现微管蛋白在未受刺激和EGF刺激的A431细胞中都存在，而激活的AKT仅在EGF刺激后存在。使用BioRad VersaDoc™MP4000系统收集荧光蛋白印迹数据。
图4:Western blotting验证AKT的活化
结论
发生的(受激发射耗竭)显微镜允许研究细胞的结构细节低于70纳米分辨率范围如上所示。发生的显微镜，在与传统共聚焦显微镜的直接比较，允许评估蛋白质的相互作用，以前不可见的常规显微镜分析。算法允许图像反褶积和颗粒大小的确定。在共聚焦图像中观察到的抗体反应性表明，AKT在EGF刺激后向细胞外周短暂迁移。瞬时EGF刺激与之前在细胞裂解物中观察到的结果一致;因此AKT的迁移定位可以通过大量的AKT信息来解释[4］．微管蛋白在AKT附近被观察到，并可能促进AKT活化后的迁移。微管蛋白与AKT迁移相关的观察是新颖的，值得进一步研究。AKT的Western印迹与免疫荧光显微镜细胞定位并行用于a)基于MW评估验证抗体的靶点，b)验证AKT在刺激或未刺激裂解物中的存在与否，c)验证抗体对激活AKT的特异性。
齿顶高
所有实验包括玻片的免疫细胞化学和徕卡成像TCS发生的是由Myriam Gastard博士进行的。在徕卡微系统设188金宝搏的网址施，应用和技术支持小组，埃克斯顿，宾夕法尼亚州。