受激拉曼散射显微镜探测神经退行性疾病

一些最常见的神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病（AD）和帕金森病，其特征是受影响的脑组织出现局部病理结构，相应地，神经症状也越来越严重。这些组织病理学的一个常见特征是，它们通常涉及异常折叠的蛋白质和相关的富含脂质结构的复杂聚集体[1–4]．然而，尽管经过几十年的深入研究，这些疾病的分子机制仍不完全清楚，观察到的组织病理是疾病的原因还是后果仍不清楚。

因此，对能够提供脑组织病理结构的日益详细的生化和生物物理特征的方法的需求越来越高。在最近的预印本中［4］，我们展示了受激拉曼散射(SRS)显微镜的潜力，以提供独特的视角，了解病理淀粉样蛋白-β (a β)聚集物和来自AD小鼠模型的受影响脑组织中相关脂类物种之间的相互作用。特别地，我们展示了一种双色SRS程序，能够在大脑中大量健康蛋白质含量中对病理a β聚集物进行干净、无标记的可视化。此外，SRS光谱成像可以对大脑脂质进行详细的空间分辨率分析，并在健康和患病的大脑结构中显示出几种相关脂质的明确差异定位。

在下面的文章中，我们将对我们的研究结果进行简要的总结。进一步的细节，请参阅完整的手稿［4］这是公开的。

带有淀粉样前体蛋白和表现出ad样病理的早衰蛋白1突变的小鼠未标记的大脑切片[5,6]来自德国神经退行性疾病中心(DZNE, Germany Bonn)的合作者提供的研究结果。相干反斯托克斯喇曼散射(汽车)显微镜和受激拉曼散射(SRS)使用SP8汽车显微镜从徕卡微系统与SRS附加。188金宝搏的网址并行获得额外的非线性光学信号(2光子自荧光，二次谐波产生)。图1显示了皮质、海马区和交织的白质区的大面积SRS图像。在这里，脂类的分布是由来自CH的SRS信号显示的₂在2850厘米处拉伸振动^－１．因此，富含脂质的结构呈现出明亮的颜色，如胼胝体(CC)的白质束和遍布皮层的有髓神经元(C)，而缺乏脂质的结构，如神经元细胞核，呈现出黑色。此外，图1还显示了皮层中大量的局部富脂结构，这些结构只在病变的大脑切片中可见。在接下来的研究中，我们发现这些结构与淀粉样蛋白相关的病理性脂质沉积相对应B斑块。

为了在不需要荧光标记的情况下研究阿尔茨海默氏病的病理，首先，我们设计了一种双色SRS程序，专门可视化大脑中健康蛋白质和脂质含量之间的病理a β聚集(图2)。我们利用了酰胺I模式的频移，这种模式产生于肽错误折叠成β片结构，就像a β肽聚集形式的情况一样。通过在1675厘米处取SRS对比度的比率^－１（错误折叠酰胺I模式的峰值）和1665 cm^－１（“常规”酰胺I模式），我们能够获得脑组织中aβ聚集体的清晰特征（图2的右图）。

这一比例淀粉样蛋白-β信号与2850cm脂的已知对比度的组合^－１使我们能够研究脂类与病理性淀粉样蛋白-β聚集物的共定位行为。如图3所示，我们发现Aβ聚集体的核心始终被突出的晕状排列的富脂沉积物包围。健康的大脑切片既没有Aβ聚集，也没有大量的脂质沉积遍布整个皮质。

观察到的脂质沉积物形态复杂，由多个不同的特征组成，大小从几微米到十微米不等。其中一些结构表现出细胞样的外观，具有凸形和圆形的中心核，其中脂质浓度较低，类似于细胞核。有趣的是，早期使用荧光显微镜的研究表明小胶质细胞/巨噬细胞可以被招募到Aβ斑块中。

观察到的脂质结构与a β聚集的关联特别有趣，因为最近的假设表明，某些类型的脂质可能通过影响脑内神经毒性a β物种的运输而在AD的进展中发挥作用。因此，我们决定采用SRS光谱成像技术对这些脂质沉积物的生化组成进行更详细的研究，也称为高光谱SRS成像。代表性的SRS图像和光谱如图4所示。

病理性脂质沉积的SRS光谱如图4中的绿色所示。为便于比较，还显示了富含脂质的健康白质、富含蛋白质的灰质和神经元细胞核的光谱。特别是指纹区域（1800-500厘米^－１)提供丰富的光谱内容，使组织的详细生化特性。白质和病理脂质结构都显示出高浓度的不饱和脂质(1665厘米)^－１)，但几乎没有脂质氧化的迹象(来自1750厘米处的酯基的信号^－１在很大程度上是没有)。进一步的签名在900-1400厘米^－１该范围将允许对脂质进行更详细的指纹分析，然而，由于蛋白质信号的背景也存在于该范围内，因此该分析变得复杂。令人惊讶的是，在700厘米左右的区域内，明显微弱的信号^－１再次包含几个高度相关的脂类物种的重要信息。图5详细介绍了该区域。

放大650-790厘米的光谱^－１图5所示的区域显示了一些脂质特异性共振:在705厘米处发现的固醇环呼吸模式^－１，如预期的那样，胆固醇在健康的白质(图像顶部)中高浓度存在，但对Aβ斑块相关的脂质沉积没有显示出太多的特异性定位(图像底部)。相比之下，膜磷脂，如磷脂酰胆碱和鞘磷脂(通过在725厘米处的胆碱组振动可见^－１)发现在斑块相关脂质沉积中高度富集。磷脂酰乙醇胺（765cm^－１)是大脑中另一种突出的脂类，在整个组织区域更弥漫性，似乎在AD病理中没有明显作用。

脂质与病理性Aβ结构的相互作用与AD疾病进展的相关性正在积极研究中。之所以具有这种活性，是因为脂质被认为具有以类似洗涤剂的方式从较大聚集体中提取小Aβ低聚物的能力，从而促进被认为完全由小Aβ低聚物产生的神经毒性。此外，包括胆固醇在内的几种主要脂质类的异常代谢或转运与AD有关。

我们对a β斑块附近脂质沉积的光谱分析揭示了这些病理结构中重要脂质物种的明显差异定位:斑块相关的沉积物富含膜脂磷脂酰胆碱和鞘磷脂，但其胆固醇含量远低于附近健康的富含脂质的大脑结构。这些观察结果为斑块相关脂质的来源提供了重要线索，提示附近的神经突膜是更可能的来源，而不是与异常胆固醇运输相关的潜在替代机制。部分脂质结构在形态上与小胶质细胞/巨噬细胞相似。因此，研究大脑的先天免疫系统是否能够在招募脂类物种到神经退化部位中发挥作用，以及是否可以利用这种机制来对抗这种疾病，将是一个有趣的未来研究方向。

综上所述，我们的研究结果突出了SRS在更广泛地深入理解神经退行性疾病方面的潜力(1 - 4、7、8)．在未来，我们预计SRS的光谱成像能力将在生命科学和医学的许多领域实现类似的应用。这些领域包括从细胞和组织生物学的基础研究到疾病机制的临床前研究，再到组织病理学和诊断成像的应用，以及广泛疾病的新型生物标志物的鉴定。

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2. Shahmoradian, S. H.等。帕金森病的路易病理包括拥挤的细胞器和脂质膜。中国神经科学。22,1099-1109(2019)。
3. Ji，M.等人。用受激拉曼散射显微镜对阿尔茨海默病淀粉样斑块进行无标记成像。Sci。Adv.4，eaat7715（2018年）。
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