谐振式脉冲扫描仪的智能控制

“生物学是一门研究生命和生物的自然科学”，这是维基百科上生物学词条的介绍性句子[２]．过去的显微镜主要研究死的物体(虽然以前是活的)，而生物显微镜的最终目标是使活的物体可视化。虽然小的生物样本通常看起来不活跃，但微观视图揭示了活跃的活动。细菌有快速移动的鞭毛，细胞和组织的代谢物变化非常快，囊泡以极快的速度运输，电信号以毫秒级的动作电位传播。为了完成这些活动，需要高帧率。共聚焦显微镜的早期方法是引入并行技术，例如旋转圆盘系统，但它们缺乏真正的共聚焦切片性能。单点扫描器提供最好的光学切片性能，但通常被认为是缓慢的。采用谐振脉冲扫描仪，现代技术可以达到每秒500帧的帧率。本文将展示如何克服这些设备的限制。

为了在二维区域上扫描光点，光束的角度必须改变。通过在光束路径中插入反射镜使光束偏转，这一任务很容易解决。为了进行扫描，镜子必须是可旋转的。旋转镜的黄金标准是采用所谓的“脉冲扫描仪”。这些设备已广泛应用于激光放映机中，用于激光表演和电影放映。

“检流计”一词起源于电计量学。为了测量电流，将线圈插入磁场中。针被安装在线圈的旋转轴上。只要电流流过线圈，洛伦兹力就会引起针的偏转。电流越高，反复位力的偏转越宽。挠度可以校准以测量电流。

另一方面，如果电流是已知的，就可以产生所需的偏转。对于光指向应用(扫描仪)，针是由一个镜子交换。当一束光照射在镜子上时，反射角的变化是旋转角度的两倍。

为了精确定位，旋转角度由安装在旋转杆另一侧的位置传感器解码。反馈系统控制驱动电流，以确保偏转始终准确地处于所需的角度。这允许在可用的xy平面的所有点上控制扫描速度和静态定位。这些扫描仪被称为“闭环”，由于封闭的反馈系统。在成像应用中，一个重要的模式是锯齿扫描。以所需的速度进行线扫描是通过以所需的速度在一个方向(“x”)上线性移动光斑来完成的。然后，为了重复扫描，镜子以最大速度向后移动到起始角度。这种模式是可能的慢线频率作为正弦扫描的替代方案。一个二维扫描-标准应用-是通过引入第二个扫描仪垂直进入光束路径生成的。第二个(“y”)扫描器生成第二个轴上的增量。显然，与x扫描仪相比，y扫描仪的速度(在标准条件下)要慢得多，因此限制要少得多。

在500hz线频率和512 × 512像素的全帧下，帧速率达到每秒一帧。对于固定样本，这是足够的时间分辨率，并提供了很大的信噪比。另一方面，当成像快速移动的物体时，帧率超过每秒100帧(最好是每秒500个)。如果这些图像每帧有10行(“条带扫描”)，则需要一个每秒可以生成5000行的扫描仪。

尽管扫描仪和扫描镜是用轻质材料制成的，而且尽可能小，但它们是产生巨大惯性的机械设备。因此，在更高的速度下，他们只能进行正弦扫描。在极端的情况下，扫描仪已经被开发出来，只能在正弦模式下扫描，而且只能在共振频率下扫描。就像一个秋千，这些设备只能改变它们的振幅(通过输入更多的能量)和它们的相位，周期相对于外部标准的位置。目前，12000赫兹频率的谐振脉冲扫描仪是可用的。当在前后训练(双向成像)中记录数据时，用于成像的线频率可以达到24000，对应于~45全帧每秒，大约与大多数现代电影使用的频率相同。在黑暗的一面，这些共振扫描仪无法控制位置和扫描频率。这种扫描仪提供电磁敲击反馈，但这太不准确了，没有任何用处。

显微镜有圆形光学。如果你从显微镜下看，你看到的是一个圆。在给定的放大倍率下，你能观察到多少样本是由场数FN (Sehfeldzahl, SFZ)指定的，它是目镜场平面(中间像平面)上图像的直径，单位为mm。如果使用40倍透镜和场号为25的目镜，那么您可以观察到的实际区域是一个直径为625 μ m的圆。当然，如果要获得良好的成像，镜头必须经过足够的校正才能处理如此大的视场，而且为了确保足够的图像质量，通常要将视场限制在共焦扫描范围内。扫描图像通常是方形或矩形的。如果扫描指定的整个场(例如上述的SFZ 25)，那么矩形的对角线等于场号，一个40倍的透镜将给出625µm作为对角线。如果扫描一个正方形，边缘对应442 μ m × 442 μ m。

而不是扫描整个场，这是非常简单的，只扫描它的一部分，只是通过降低振幅(延伸)的脉冲扫描仪。如果扫描振幅为一半，则只记录各自维度的一半。然后正方形的面积对应于全场扫描的四分之一。

当然，像素的数量是相同的，当显示在显示器上时，显示器的大小也不会改变。本质上，较小的扫描产生了两倍的额外放大倍率。这种额外的放大倍数是无级可调的，称为“扫描变焦”。它不是由光学元件获得的，因此不应与光学变焦装置混合。因为它不是显示所记录像素数据的变体，所以它也不应该与显示缩放选项混合在一起。事实上，扫描变焦是由扫描设备的机械性能控制的机械变焦(尽管这是由电子驱动和电子控制和计算机化)。

由于没有限制降低扫描振幅，直到它达到零，扫描缩放可以提供无限放大。然而，就像普通显微镜中的目镜放大倍率一样，有一些规则来定义扫描缩放何时越过有意义的使用范围。这些规则取决于镜头的分辨率和放大率，以及每个维度记录的像素数。对于成像，很少需要超过20倍的扫描缩放。高变焦系数仅用于激光操作，例如漂白或光激活。

由于不同厂家使用不同的字段号，扫描变焦的绝对值是不具有可比性的。为了进一步混淆运算符，有些甚至使用了小于1的缩放因子。更合理的值应该是实际使用的场数，只需计算扫描区域的对角线，然后乘以物镜的放大倍率。有了这样的指示器，甚至可以比较不同光学放大倍率(不同物镜)下的性能。

当不扫描整个(光学)场时，可以自由选择扫描场的哪一部分。这个函数被称为“平移”，需要对扫描偏移量进行编程，即扫描仪不是对称操作的。这只适用于闭环扫描仪。共振扫描仪需要不同的平移解决方案。

如前所述，扫描时的速率限制元素是x脉冲。如果回溯不需要空闲时间，扫描仪可以以完美的锯齿工作，则每个像素的时间为1/f*x, f为扫描频率，x为像素数。对于真正的扫描仪，这是不完全达到的，因为缩回时间是有限的，机械伸长的“末端”被切断，因为它们显示非线性。在较高的速度下，可编程扫描仪在正弦模式下运行，当然，这也可以用于较慢的速度。共振扫描仪只能进行正弦扫描。

如果扫描的是正弦曲线，那么时空关系就不再是线性的。由于图像失真是不可接受的，因此必须在x和y上等距离地记录强度，对应于时间上的不等距离记录。因此，在扫描器移动更快的直线中间，数据记录(像素)的开始时间更密集，而在直线两端，由于扫描速度在末端为零，并开始向相反的方向移动，因此距离较远。对于这个问题，一个不完全合适但可能的解决方案是只使用正弦函数的中间部分，这是近似线性的。但这样就会损失90%的可用扫描时间(而激光一直处于开启状态)，并且需要以更宽的振幅进行扫描，这反过来又会减慢脉冲扫描仪的速度。因此，我们使用更大的分数，例如一个火车的80%(在双向模式下运行时，时间周期为60%)，并应用非线性像素时钟。这种非线性像素时钟很容易通过闭环扫描仪获得，因为它们提供了用于外部使用的位置解码。非线性像素时间的第二个影响是每个像素的记录时间也是位置相关的。如果使用标准的电荷放大器进行强度-电流转换，边缘的像素会更亮。此外，与扫描中心相比，边缘的噪声更小。 For normal imaging, this is not an issue. Noise-dependent methods, such as raster image correlation, will suffer from such records, as the noise is high in short pixels and lower in long pixels. Here, one has to ensure constant integration times throughout the scanned area (which is at maximum the length of the shortest pixel in the center). High frequency sampling and intrapixel accumulation[3]typo3 /正如用徕卡共聚焦显微镜所介绍的那样TCSSP5允许独立于位置和速度控制每个像素的积分时间。

谐振扫描器是不可编程的速度和扫描偏移和缺乏精确的位置读出。为了仍然使用共振扫描仪，这些缺点需要得到补偿。1995年R. Tsien在Pawley的共聚焦手册中描述了第一个使用光学尺作为样本时钟的可行解决方案[4]．这种方法利用第二个低功率的红色激光指向扫描镜的后方(也是反射)作为位置探头。反射的探针光通过一个由透明和非透明条纹(Ronchi光栅)组成的光栅，非常像尖桩栅栏。探针光在光栅上扫描，然后由光电二极管检测到光。由于尖桩栅栏是等距的，扫描仪是正弦运动的，调制后的探测光产生具有正弦脉冲长度的明暗模式。这些图案的侧面可以用作像素时钟，它在时间上是正弦的，但在扫描场空间中是等距离的。

虽然这个概念解决了非线性像素时钟的问题，但它有其局限性。像素的最大数量由光栅中的网格元素数量决定。像素的数目只能以栅栏中板条数目的整数分数进行切换。

可用的变焦系数取决于适当的光栅的可用性:更高的变焦系数需要更短(和更密集)的光栅，以获得相同的像素数。因此，没有连续变焦的方法，当切换变焦时，必须改变探测光束路径中的光栅。因此，光栅存储库中必须有一组光栅——通常是一个可旋转的圆盘。

用这种机械参考测量方法无法进行平移。

我们如何设计一个谐振扫描仪的控制，既允许连续缩放，又可以选择任意数量的像素到最大值?根据用户要求进行单向或双向扫描?一个稳定和精确的解决方案是由徕卡与TCS2000年SP2。这一概念已被应用于徕卡谐振扫描仪系统。

谐振式脉冲扫描仪是扭谐振荡器。它们以调和运动作旋转振动。因此，它们的运动模式是严格的正弦函数。我们所需要做的就是测量运动中的扫描仪的实际相位和振幅，并将其与激励信号进行比较。测量是由一个红外二极管照到扫描镜的后表面。为了检测信号，采用了位置敏感装置(PSD)。这是一种无定形的连续测量装置，不像光栅，它有预定义的元素数量(限制了测量的分辨率)。从中，我们可以通过锁定方法提取出精确的振幅和相位，这使我们能够创建一个类似于镜子真实运动的合成正弦函数。这是可能的，因为共振脉冲的q因子在1000的范围内。这意味着，即使由方波激发，系统也始终在谐振频率处正弦振荡——偏差小于0.1%。 The resonance frequency depends on temperature and other environmental parameters, but as we measure the frequency, we can be sure of operating the scanner at the optimal frequency. This method does not rely on accuracy of gratings, nor on adjustment and replacement of such gratings or other mechanical or optical aids. By high-quality measuring amplitude and phase of the oscillator, we have very exact knowledge of the position of the mirror at all times.

现在知道了点在任何时刻在样本中的位置，我们可以将检测到的信号分配到x和y(和z)的空间坐标中，并且我们可以自由地分解检测到的强度(我们用高频采样器连续测量)，以任何数量的像素为单位。也就是说:如果最大像素数是每行1000个，理论上我们可以要求1到1000之间的任何扫描格式。

此外，我们可以决定使用所有测量信号，这对应于x扫描边缘较长的像素时间。或者，为了确保相等的属性来测量更高的时刻，如相关性研究的强度方差，我们可以在x扫描过程中将像素长度限制为常数。

当我们测量和控制振幅时，我们可以不断地改变场的大小。这就是:连续缩放，这是不可能的机械网格参考。

如果我们想要移动显微镜视野中的放大区域，我们可以将共振扫描仪安装在一个可旋转的设备上，这允许添加一个机械偏移(这里:在x方向)。在这些条件下，位置敏感装置和锁定系统振荡特性的提取仍然可以工作，这使得我们也可以使用共振扫描的pan功能。

1. Widzgowski B和Birk H: Verfahren zur Ansteuerung eines Scanmikroskops。专利申请DE 10 2007 008 009 B3(2007)。
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Biology(6月28日^th, 2014)。
3. Borlinghaus RT和Young S:效率和速度-共焦数据采集的新范式。成像与显微镜8(4):58-59(2006)。
4. 钱永瑞，Bacskai BJ:视频速率共聚焦显微镜。见:生物共聚焦显微镜手册。埃德:Pawley JB, 2岁^nded(1995)。