美国flexneri是人适应大肠杆菌有能力侵入结肠黏膜(大肠黏膜内层)，引起炎症和细菌性痢疾的细菌。这种病原体的细胞内生活方式已经得到了充分的研究在体外和志贺氏杆菌最近作为研究宿主先天免疫的炎症范式获得了认可。然而，在没有志贺菌病的天然小鼠模型的情况下，在活的有机体内的研究志贺氏杆菌发病机制(致病机制)一直受到限制［1］．

m . marinum是一种天然的鱼类病原体，可导致宿主组织中的肉芽肿性坏死病变(炎症引起的组织损伤)。这些病变在组织学上与由结核分枝杆菌它是人类结核病的病原体。同样，缺乏一个小鼠模型来完全再现这种疾病，以及与研究相关的对人类健康的风险结核分枝杆菌这使得有效研究结核病变得困难在活的有机体内．为了这个目的m . marinum-斑马鱼感染模型是理解分枝杆菌感染的核心机制的极有价值的替代品(2、3)．

非哺乳动物模型在理解各种疾病(感染、癌症、神经退行性变)和开发改善人类健康的治疗方法方面都很重要。特别是，斑马鱼是一种脊椎动物模型，在遗传、发育和生理上都与人类有显著的相似性［4］．斑马鱼繁殖能力强，体外受精，生命周期短。从实用的角度来看，这些特征意味着大量的胚胎可以随时、持续地用于研究。此外，斑马鱼的幼虫阶段自然是半透明的，提供了一个独特的机会来形象化和解剖在活的有机体内荧光细胞在转基因幼虫中的行为。特别是，感染模型可以受益于斑马鱼系的荧光标记免疫细胞，使在活的有机体内白细胞成像(白细胞:巨噬细胞，中性粒细胞)及其在炎症和感染性疾病中的作用。

在这里,我们使用美国flexneri和m . marinum斑马鱼感染模型研究中性粒细胞对感染的招募在活的有机体内．荧光标记细菌在感染转基因幼虫期间的活成像显示高度病原体特异性的中性粒细胞招募。值得注意的是，当我们观察到中性粒细胞的快速和强大的招募时美国flexneri感染，类似的剂量m . marinum未刺激明显的中性粒细胞向感染部位迁移。这些数据强调了活体成像在了解宿主对细菌感染的反应方面的价值。

斑马鱼的护理和保养

所有试验均以受精后5天以内的斑马鱼幼虫为试验对象，在自由取食前进行。因此，本文所报道的实验都不属于英国和欧盟的动物实验法规。按照欧洲联盟关于处理实验室动物的指导方针和1986年伦敦帝国理工学院动物(科学程序)法案，饲养成年繁殖鱼。所有实验和程序均由内政部批准(项目许可证:PPL 70/7446)。通过自然产卵获得卵，在含有0.5X E2胚胎培养基(如前所述添加0.3 mg/ml亚甲基蓝)的培养皿中清洗并保存。显微镜下，受精后24小时胚胎培养基中添加0.003% 1-苯基-2-硫脲(hpf)以防止黑色素的合成。图1显示了伦敦帝国理工学院的斑马鱼饲养设施。

细菌的准备

本研究使用的菌株有:

1)野生型(wt)美国flexneri(M90T株)表达红色荧光蛋白mCherry;

2) Wtm . marinum(M株)表达mCherry［5］．

对于斑马鱼幼虫的微注射，通过离心、洗涤和在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬所需浓度(~500 CFU/nl)的方法收获细菌。

斑马鱼幼虫的细菌感染

在注射过程中，用200mg /ml三卡因麻醉幼虫。在3dpf时，将置于琼脂糖注射板上的幼虫以1nl (~500 CFU)的任何一种微量注射到后脑室(HBV)美国flexneri或m . marinum细菌悬液或干净的PBS溶液作为对照。注射使用IM 300微量注射器(Narishige)和aM80立体显微镜(徕卡微系统)如前所述188金宝搏的网址［6］．接种物被证实后验注射到一滴PBS中，并进行细菌电镀。图2a-b显示了细菌和幼虫制备和显微注射的实验室设施。

斑马鱼幼虫活体成像

斑马鱼乙肝病毒具有高度的成像能力，能够随时间跟踪注射的致病菌和白细胞。将麻醉后的斑马鱼幼虫定向固定在1%低熔点琼脂糖中，并用含三卡因的0.5X E2培养基覆盖，进行中性粒细胞向注射部位募集的体内成像。光场和荧光广域成像是使用M205足总荧光立体显微镜(徕卡微系统)。188金宝搏的网址每15分钟采集一次多场z叠加(多聚焦成像)。自动化阶段允许同时跟踪数只动物(3只PBS注射对照幼虫、4只感染海粟粒菌的幼虫和5只感染弗氏杆菌的幼虫)。图3a-c显示了两位合著者对幼虫的成像。

中性粒细胞量化

使用先前发表的Tg(mpx:eGFP)转基因斑马鱼系和表达增强绿色荧光蛋白eGFP的中性粒细胞进行定量［7］．荧光立体显微镜拍摄的图像被处理成电影，并使用ImageJ软件进行分析［８］．在感染后1和6小时(hpi)对招募的表达egfp的中性粒细胞进行量化。统计数据通过Graph pad棱镜的Student’s t检验计算。

中性粒细胞是高度运动的固有免疫细胞，经常对入侵的病原体作出快速反应。因此，中性粒细胞募集、吞噬和病原体破坏对许多感染的最初遏制非常重要。我们在这里展示斑马鱼幼鱼的中性粒细胞显示出强烈的招募美国flexneri．相比之下,m . marinum基本避免了中性粒细胞的检测(图4a-b)。量化显示,美国flexneri与对照组(仅PBS)相比，注射后的鱼后脑室中性粒细胞数量已经增加了1 hpi，增加了2.7倍，在6 hpi时增加了3.0倍(图5)m . marinum在两个时间点(1 hpi或6 hpi)检测时，后脑室感染与对照幼虫无显著差异。

这些观察结果与之前的研究一致，研究表明美国flexneriHBV感染可触发各种炎症介质的激活，并诱导积极招募中性粒细胞的趋化线索(9、10)．另一方面，研究使用m . marinumHBV感染已经证明趋化线索是微不足道的［11］．数据显示，中性粒细胞只在感染的较晚、较晚期和炎症阶段与分枝杆菌相互作用，即在组织中形成肉芽肿(由聚集的巨噬细胞引起的炎症)时［11］．在这种情况下，中性粒细胞被死亡的感染巨噬细胞无法控制的碎片所吸引m . marinum感染。

不同的炎症和化学引诱特性年代。flexneri和m . marinum证明宿主-病原体相互作用的“微调”在活的有机体内．志贺氏杆菌是一种肠杆菌，依靠炎症破坏肠道上皮内层来入侵、生存和复制宿主。炎症是由病原体分泌的毒性因子介导的。侵入肠道上皮后，宿主的转录重编程产生趋化因子，如强效中性粒细胞引诱剂白细胞介素-8 (IL-8)。［12］．虽然中性粒细胞对杀死细菌很重要，但它们也可以破坏肠道上皮，促进无法控制的细胞入侵志贺氏杆菌．

相比之下,m . marinum(类似于结核分枝杆菌)会导致慢性感染。这些细菌将病原体相关分子模式(PAMPs)隐藏在一层表面脂质之下，以逃避先天免疫识别的早期阶段［13］．众所周知，分枝杆菌利用复杂的机制(如诱导Ccl2和Cxcl11)在巨噬细胞内建立生态位，以特异性地吸引巨噬细胞(13、14)．在巨噬细胞生态位中，m . marinum可以复制并在宿主内传播。播散的细菌形成肉芽肿性病变，这是分枝杆菌感染的标志，它作为细菌保护屏障，减少免疫细胞的进入［15］．

斑马鱼是一种新兴的模式生物的研究志贺氏杆菌以及分枝杆菌感染，对我们理解细菌是如何致病的做出了重大贡献在活的有机体内．利用斑马鱼幼虫的感染，细菌和宿主细胞之间的相互作用可以得到高分辨率的成像。在这里，我们利用透明斑马鱼幼虫的光学可及性来研究美国flexneri和m . marinum中性粒细胞(粒细胞白细胞)。这些观察可以帮助我们更好地理解宿主对重要细菌病原体的防御，并阐明控制人类细菌感染的新方法。

1. 桑索内蒂(2004)。IL-8是一种关键的趋化因子，在志贺菌诱导的结肠炎新小鼠模型中调节中性粒细胞招募．J Immunol 173, 4197-4206, DOI: 10.4049/jimmunol.173.6.4197。
2. Ramakrishnan, l(2013)。在斑马鱼体内观察结核性肉芽肿．Adv Exp Med Biol 783, 251-266, DOI: 10.1007/978-1-4614-6111-1_13。
3. 高木，戴维斯，J.M.，翁李，K.， Ramakrishnan, L.(2013)。斑马鱼海水分枝杆菌感染的发病机制与治疗评价．Nat Protoc 8,1114 -1124, DOI:10.1038/npro .2013.068。
4. 韦斯特菲尔德,M。斑马鱼书:实验室使用斑马鱼(Brachydanio) rerio的指南斑马鱼信息网。
5. Mostowy, S.， Boucontet, L.， Mazon Moya, M.J, Sirianni, A.， Boudinot, P.， Hollinshead, M.， Cossart, P.， Herbomel, P.， Levraud, J.P.， Colucci-Guyon, E.(2013)。斑马鱼作为研究福氏志贺氏菌与吞噬细胞相互作用和细菌自噬的新模型．PLOS Pathog 9, e1003588, DOI: 10.1371/journal.ppat.1003588。
6. Mazon Moya, M.J, Colucci-Guyon, E.， Mostowy, S.(2014)。利用福氏志贺氏菌研究细胞自噬与细胞骨架的相互作用．acta physica sinica, 2017,32(4): 497 - 503。
7. Renshaw, s.a.， Loynes, c.a.， Trushell, d.m.， Elworthy, S.， Ingham, p.w.， Whyte, M.K.(2006)。中性粒细胞炎症的转基因斑马鱼模型。血108,3976 - 3978。DOI: 10.1182 / - 2006 - 05 - 024075血。
8. 施耐德，拉斯班德，W.S.， Eliceiri, K.W.(2012)。NIH Image to ImageJ: 25年的图像分析。Nat方法9, 671 - 675 DOI: 10.1038 / nmeth.2089。
9. Willis, a.r.， Moore, C.， Mazon-Moya, M.， Krokowski, S.， Lambert, C.， Till, R.， Mostowy, S.(2016)。注射掠食性细菌与宿主免疫细胞共同治疗斑马鱼幼虫志贺氏菌感染，《当代生物学》，第26卷，iss。24，第3343-3351页，DOI: 10.1016/j.cub.2016.09.067。
10. Mazon-Moya, M.J, Willis, A.R, Torraca, V.， Boucontet, L.， Shenoy, A.R, Colucci-Guyon, E.， Mostowy, S.(2017)。septin抑制炎症，保护斑马鱼幼虫免受志贺氏菌感染， PLOS, DOI: 10.1371/journal.ppat.1006467。
11. 杨,C.-T。，Cambier, C.J., Muse Davis, J., Hall, C.J., Crosier, P.S., Ramakrishnan, L.,中性粒细胞通过氧化杀死感染巨噬细胞吞噬的分枝杆菌在早期结核肉芽肿中发挥保护作用《细胞宿主与微生物》(2012)第12卷，第1期。3，第301-312页，DOI: 10.1016/j.chom.2012.07.009。
12. Sansonetti P.J.(2006)。志贺氏菌对肠道屏障的破坏、侵袭和炎症破坏:先天免疫的阴阳关系．Can J infection Dis Med Microbiol 17, 117-119, DOI: 10.1155/2006/189784。
13. Cambier, c.j.， Takaki, k.k.， Larson, r.p.， Hernandez, r.e.， Tobin, d.m.， Urdahl, k.b.， Cosma, c.l.， Ramakrishnan, L.(2014)。分枝杆菌通过膜脂的协调使用操纵巨噬细胞的募集．Nature 505, 218-222, DOI:10.1038/nature12799。
14. Torraca, V.， Cui, C.， Boland, R.， Bebelman, J.P, van der Sar, a.m.， Smit, M.J, Siderius, M.， Spaink, h.p.， Meijer, A.H.(2015)。CXCR3-CXCL11信号轴介导分枝杆菌感染的巨噬细胞募集和传播．Dis模型Mech 8, 253-269, DOI: 10.1242/dmm.017756。
15. Cronan, m.r.， Beerman, r.w.， Rosenberg, a.f.， Saelens, j.w.， Johnson, m.g.， Oehlers, s.h.， Sisk, d.m.， Jurcic Smith, k.l.， Medvitz, n.a.， Miller, s.e.， et al.(2016)。巨噬细胞上皮细胞重编程是分枝杆菌肉芽肿形成的基础并促进感染．免疫45,861-876,DOI: 10.1016/ j.k imuni. 2016.09.014。