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集成调制对比度(IMC)

斜向照明增强活细胞的可视性

Hoffman调制对比度已成为观察未染色,低对比度生物标本的标准。其创新的技术实现允许在部署方面更简单地处理和更大的灵活性。调制器在现代倒置显微镜的光束路径中的集成允许使用广泛的明场或相位目标,而不是小型特殊目标。现在,可以使用可自由访问的调制器来修改和优化对比度。

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调制对比度

调制对比度是宽视野显微镜下的一种对比度增强方法,它将未染色标本和活细胞的光学梯度或斜度转换为不同的光强度。它是由罗伯特·霍夫曼在1975年发明的,使用一个狭缝板来实现倾斜照明,并使用一个调制器来进行光强调制。由于标本的三维外观,调制对比在医学和生命科学中的主要应用是微操作技术,如IVF中的ICSI(胞浆内精子注射)和转基因中的克隆和原核注射。

光路中的特殊组件

光路中的至少两个特殊部件对于调制对比度照明是必需的。为了使倾斜照明能够放置在冷凝器的前焦平面中。其次,将调制器放置在物镜的后焦平面中。调制器包含具有不同光密度的三个指定区域:一个透明区域,一个透明区域,允许15%,允许1%的允许。通过调制器的光通过称为调制的定义。

除了上述组件之外,含有偏振器的第二狭缝通常可以在滑板中找到。与位于显微镜的冷凝器顶部的另一偏振器结合,该偏振器可用于控制有效的狭缝开口(通过打开90°(暗)位置)并实现浮雕效果。注意,样品不位于偏振器之间,其允许采用双折射塑料或玻璃容器。然而,偏振器不是调制对比的先决条件。

调制对比度将相位梯度转换为亮度梯度

细胞的许多组分通过先天性属性导致透射光的相位变化。这些性质可能是特定结构的斜率和陡度,该结构改变折射率变化率或简单地改变给定结构的厚度。随着这些性质(例如细胞厚度)经常在某个区域逐渐变化(而不是立即改变),在该区域上的光相变化也逐渐地产生相位梯度。相位梯度将衍射入射光,引起光的偏转角度的变化。

由于调制对比度采用的是倾斜照明,偏转角度的变化会受到很大的影响,与无偏转的光相比,光会在不同的区域通过调制器。在生成的图像中,在坡度、陡度、厚度等方面比较均匀的单元区域将以灰色显示。对于图像的背景也是如此,因为通过这些均匀区域的光线不会由于样品的相位梯度而经历相移,也不会发生偏转。

在调制造影系统中,不偏转光通过15%光许可的调制器中的区域,导致细胞和背景的均匀区域的灰色颜色。当光通过导致相移的样本区域(例如,细胞膜的斜率的变化)时,光被偏转为暗(1%允许)或调制器的透明(100%允许)面积。当样品倾斜地照射时,图像将从梯度的一侧(其中光被偏转为1%允许的区域),并且从梯度的另一侧更亮(光线与该区域偏转100%许可)。

IMC提供更多自由

在集成调制对比度(IMC)的情况下,调制器在梁路径中的焦平面(图4)中的焦平面缀合的焦平面(中间瞳孔)中的物镜的外部集成在焦平面的外部。调制器安装在滑块上,该滑块插入支架侧面(图5)的夹层中。因此,它们可以自由访问,并允许用户根据需要轻松调整对比度。除此之外,还可以使用具有不同变速器的调制器。滑块还具有用于未调制图像的亮野位置。已经建立了具有IMC的显微镜,以确保对比度的定向(3D印象的阴影方向)对于所有目标都是相同的。因此,当改变目标或放大倍率时,样本的空间印象保持不变,因此不需要调节狭缝隔膜。

解耦调制器时需要考虑的一个基本问题是物镜的后焦平面可以在45mm焦距范围内的任何地方。因此,在物镜外的调制器必须至少移动这个距离。由于徕卡物镜的设计,它被定义为固定的焦平面,在倒置显微镜的部署和固定的放大倍数从5倍到63倍,它可以减少调制平面的数量到两个瞳孔位置(图6)。

瞳孔图像,所谓的中间光瞳的图像的光束路径设计为1x望远镜系统。目标背后的无限梁路径在中间瞳孔中再现。结果,任何厚度的平面平行光调制器也可以插入中间瞳孔的光束路径中,倾斜或直接,而不会损害图像的位置或质量。通过望远镜系统的最佳单色和色校正以及IMC调节剂的蒸汽沉积灰度和深金属涂层的极低反射性能,最小化杂散和假光。

单独变量参数

IMC提供了大量的用于个人调整调制对比度的范围。调制器可垂直调节以始终提供均匀的图像。因此可以补偿样品盘内的不同阶段或缓冲溶液水平和不同的细胞的不同位置。移动调制器侧面改变了分辨率:进一步调制器和狭缝膜片向外移动,分辨率越高(最大分辨率Res =λ\ 2na)。

两个调制器参数会影响对比度的强度:变速器和灰色区域的宽度。减少传输增加了对比度。例如,传输25%,导致平滑对比度。值约为10%,对比度变得显着减少。改变调制器宽度类似地有效(图7)。

缩小灰色区域会导致更清晰度的对比度,而宽的调制器会软化整体图像印象。IMC的狭缝隔膜具有两个开口。第一狭缝在调制器的灰色区域上成像,产生用于调制对比度的倾斜照明。第二狭缝由偏振箔覆盖(图7)。位于隔膜前方的可旋转偏振器可以增加或降低调制对比度的3D效果。当使用塑料盘时,偏振器不会影响图像质量,因为光仅在照明侧被偏振,并且物镜侧没有使用分析仪。狭缝膜片的尺寸与最常用的冷凝器匹配。

因此,IMC不仅适用于生物材料的常规考试 - 它也是一种优良的工具,用于要求微观的应用,微量注射或微放映等应用。

IMC的优点

许多优点使集成调制对比广场显微镜中的广泛使用方法。集成调制对比度允许使用倍率因素的目标,其可达63倍。不需要特殊的目标,并且可以使用高校正的目标(例如,Planchromatic和ApoChromative)进行调制对比度。这导致具有良好对比和可见性的细节的优异解决方案

调制对比显微镜的另一个优点是,与差动干扰对比显微镜不同,可以使用塑料容器和盘子,因为光路中的偏振器位于样品之前。此外,不需要Wollaston Prisms。这导致具有调制对比度的显微镜的中等成本。

参考

Hoffman,R .:调制造影显微镜:原理和性能,Microscopy,Vol 110,Pt 3,1977年8月,PP。205-222

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