样品制备
- 在透射光模式下检测SRS信号。因此，作为经验法则，标本至少应该是半透明的。
- 只要实验允许，较厚或较不透明的样品应切片至合适的厚度。根据我们的经验，50-100微米厚的切片效果很好。或者，厚的样品也可以用汽车可以在透射光和入射光(外光照明)模式下检测的显微镜。
- 标本可以是新鲜的或福尔马林固定的。与脂质相关的分析不鼓励用甲醇固定，因为已知该方法可从标本中提取脂质。当研究脂质以外的分子时，脂质含量的信号可能会干扰，因此甲醇固定可能是有益的。
- 对于新鲜样品，在长光谱扫描期间必须小心，因为它可能需要识别潜在的运动伪影。
- 标本可以夹在盖玻片和显微镜载玻片之间。与自发喇曼散射相比，非线性光信号的产生对非聚焦区域的信号有很强的抑制作用。因此，来自基板和光束路径中其他元件的荧光背景信号实际上是不存在的。另外，对基板材料也没有特殊要求。物体在夹层结构中的位置应在物镜和冷凝器的工作距离内(见下文)。因此，理想情况下，物体应直接与盖玻片和载玻片的表面接触。188金宝搏的网址
- 它是首选安装样品在水溶液或缓冲液中，例如，三明治使用双面粘性垫片。必要时，可以包埋样品(典型的荧光载体如Mowiol或Dako，水凝胶如Matrigel或琼脂糖应起作用)。石蜡包埋的切片可以通过去除或不去除石蜡进行分析。但是，我们强烈建议删除它。
- 或者，玻璃底培养皿中的标本也可以成像，例如，用TCSSP8汽车显微镜使用S1油冷凝器浸水配置。
- 在许多情况下，即使是荧光标记的标本也可以用SRS探测，而不需要荧光串扰进入SRS通道。因此，有可能将荧光图像与SRS信号关联起来。SRS对荧光信号的抗扰性来自于基于锁定的检测方案和非常多的红移检测带。在极少数情况下，当荧光污染信号存在时，通常可以在光谱分析中从真正的SRS信号中分离出来(如果有的话，荧光信号的光谱依赖性很弱，而SRS信号则会显示明显的光谱峰值)。
SRS影像工作流
选择合适的目标是至关重要的汽车/SRS，因为泵浦/斯托克斯脉冲必须在三维空间和时间重叠，以获得最佳信号强度。建议的目标是:
- 10x NA=0.4空气HC PL7月CS
- 20x NA=0.75水HC PL IRAPO
- 25x NA=0.95 Water HC FLUOTAR VISIR 0.17
- 40 × NA=1.1 Water HC PL IRAPO CORR(注:优化每个样品的CORR环的位置可能对信号强度和图像质量有显著的影响)
请注意，对于每个目标，泵浦和探测脉冲的时间重叠必须进行优化。这种延迟校准应由徕卡服务人员执行。188bet官网1
对于SRS显微镜，强烈建议使用数值孔径(NA)大于激励物镜的数值孔径(NA)的冷凝器。如果不满足这个条件，就会产生虚假的非srs信号。建议选用S1冷凝器(NA=0.9空气或1.4油)。
对于第一次检查，我们建议在预期信号最强烈的振动频率(对于典型的生物样品，这将在ch拉伸区域，例如2850厘米处)对样品进行成像－1为脂质丰富的标本或2935厘米－1富含蛋白质的人)。在这个振动频率，调整激光功率和探测器增益，以利用图像的全动态范围。SRS成像典型参数如表1所示。
| 泵，Stokes Powers在激光GUI | 100 mW(泵浦)，200 mW(斯托克斯)激光输出;保持1:2比率。 泵不要超过150mW，以免损坏SRS探测器! |
| 强度滑块 | 30 - 50% |
| SRS检测器增益 | ~满刻度的10%。只有当激光功率达到最大值时才增加。 |
表1:SRS显微镜的典型采集参数。
其他信号，如Epi-汽车和Epi-SHG/2PF通常提供进一步有价值的信息，并可并行获得。优化这些通道的采集参数。
SRS光谱成像
在开始光谱扫描之前，应该给显微镜足够的时间使其达到稳定温度并使样品沉淀下来。这种预防措施将有助于避免在光谱扫描期间的z漂移。
要设置光谱扫描，请选择xyΛ或xyzΛ扫描模式。
在如图1所示的Lambda Scan窗口中，选择扫描的起始点和结束点以及步长。我们建议将光谱扫描分为两个区域，高波数区域(HWR， ~3100 cm)－1~ 2800厘米－1)和指纹区(FPR， ~ 1800cm)－1~ 600厘米－1)，因为这些区域的信号强度和频谱复杂性不同。
HWR的典型扫描将由30-40个光谱点组成，步长为0.5 nm，可以一次性获取。
对于FPR的扫描，更小的步长0.4 nm被推荐，以充分取样更窄的光谱特征。对整个指纹区域的扫描可以很容易地由~200-300个光谱点组成，并且应该被分解成几个部分。这个步骤建议在调谐时保持激光参数的最佳稳定性。可以手动设置每个部分扫描，也可以在Live Data Mode中将部分扫描设置为xyΔ作业序列。从部分扫描中分离出来的图像序列可以稍后用处理工具合并并一起分析。
生物标本中FPR信号通常比HWR信号弱5-10倍。这通常需要增加激光功率(通常比HWR扫描高50%)，增加SRS探测器增益(通常比FPR扫描高2 -3倍)，并且，根据所需的信噪比(SNR)，可能通过线/帧平均或积累进一步增强信号。
由于FPR光谱可能相当复杂，因此应该注意，样品中任何感兴趣的结构的任何光谱点上的信号都不会饱和。如果已知最强烈信号的振动频率，则应针对这些频率优化FPR扫描的采集设置。如果不知道，那么典型的候选频率将是~1445 cm的总脂质信号－1或者，在某些情况下，不饱和脂质信号在~1655厘米－1．
在下面的图2中，工作流通过一个新切的苹果片的指纹信号光谱分析的例子来说明，查看果皮和果肉的外部区域。
光谱数据分析:
SRS光谱与自发拉曼光谱在数学上是相同的，因此，它们适用于自发拉曼光谱所开发的相同类型的定量分析程序。在实践中，SRS光谱可能更容易解释，因为几乎没有荧光背景污染，因此，不需要数据预处理步骤，如背景减去程序。
A)用户自定义光谱分析
用户定义的光谱分析首先选择roi并显示它们的光谱拉斯维加斯X，如图3所示:在“Quantify”标签下，选择“Stack Profile”，Dimension: Δ。从这里，右键单击光谱“导出”到“Excel”格式。注:光谱只节省泵浦激光波长。Stokes激光波长可在激光GUI中使用。这些波长可以转换为振动频率使用公式:
v(厘米－1) = 107(1 /λ泵(nm) 1 /λ斯托克斯(nm))
另外注意:图像roi也可以保存，以便将来使用拉斯维加斯X(当图像显示在“Quantify”选项卡→“Save ROIs”)。
B)光谱染料分离
另一种快速和直观的鉴别样品子结构的方法，基于它们的光谱特征，是“光谱染料分离”特征，内置到拉斯维加斯X软件。下面的图4对此进行了说明。
在“工艺”选项卡下，选择“染料分离”→“光谱染料分离”。再次，可以选择roi和相应的光谱可以保存/导出到染料数据库。然后可以选择所需数量的这些光谱作为分离的基础。
如图4所示，该方法适用于识别和可视化一个苹果样品中至少8个生物化学上不同的亚结构(相同的高光谱数据集如图1所示)，揭示了苹果皮不同的表皮层，具有高度不同的脂质组成，富含碳水化合物的果肉，含有类胡萝卜素的各种色素，以及含有高浓度多酚的其他隔间。
C)自动染料分离
如果只获得几张不同振动频率的图像，而不是一个完整的高光谱图像堆栈，那么“自动染色分离”就可以用来显示样品中不同的生物成分。图5显示了小鼠大脑切片的6色SRS图像堆栈，将其分成三个部分:富含脂质的白质和有髓鞘的轴突(红色)、富含蛋白质的灰质(绿色)和神经元核(蓝色)。
