冷冻固定化植物组织的电子层析：原位研究成熟植物细胞壁三维大分子结构的新方法

木质纤维素生物燃料的成本效益生产需要有效分解植物生物质中的细胞壁，以回收壁多糖进行发酵。因此，深入了解植物细胞壁成分对于改进燃料生产工艺至关重要。迄今为止，植物细胞壁内纤维素、半纤维素、果胶和木质素的精确空间三维（3D）组织仍不清楚，因为迄今为止使用的显微镜技术仅限于二维、地形或低分辨率成像，或需要分离或化学提取细胞壁。在本文中，我们证明了通过冷冻固定新鲜组织，然后冷冻切片或冷冻替代和树脂包埋，然后分别进行冷冻或室温（RT）电子断层扫描，我们可以在大分子分辨率（~2nm）下，在3D中可视化以前看不到的植物细胞壁结构细节，在接近本土的州。定性和定量分析表明，冷冻固定化样品的壁组织保存明显优于传统制备的大量提取样品。无木质素的初生细胞壁在两种自增压快速冷冻培养基中均保存完好(SPRF)，冷冻切片样品以及高压冷冻、冷冻替代和树脂嵌入（HPF FS树脂）样品。富含木质素的次生细胞壁在HPF-FS树脂切片中似乎没有特征，可能是由于染色渗透性差，但在我们的冷冻切片中，它们的大分子特征可以在前所未有的细节中显现出来。虽然玻璃组织切片的冷冻断层扫描目前被证明有助于开发富含木质素的次生细胞壁的三维模型，但我们在此确认，HPF FS树脂切片的RT断层扫描技术上更简单的方法可立即用于低木质素细胞壁的常规研究。作为原理证明，我们通过HPF FS树脂切片的RT断层扫描对突变体（cob-6）和野生型拟南芥下胚轴薄壁细胞的初级细胞壁进行了表征，并检测到突变体细胞壁中纤维素微纤丝的空间组织存在微小但显著的差异。