罗马地下墓穴光合生物膜的三维成像和色素亚细胞鉴定

石表微生物的重要活动导致了艺术作品中不受欢迎的变化。导致生物退化的生物体建立了复杂的结构群落，称为生物膜，破坏了审美印象，最终导致化学和物理损伤[1].生物退化的定性和定量表征要求了解所涉及的基质、生物体和非生物因素[2]。这些资料可帮助管理人员选择适当的预防和根除方法[3.]为有风险的文化遗产[4]．

罗马地下墓穴是构成旅游线路一部分的海底遗迹。游客自身和/或参观画廊的条件变化会导致参观区域发生剧烈变化[5，后者意味着使用人工照明。我们的最终目标是生产创新的、非破坏性的技术，以控制和防止岩石表面光合生物膜的不受控制的生长。

光质量是光合生物膜发育的决定因素，因为光是光养微生物代谢和发育的基础[6]。由于为游客安装了人工照明，指定用于旅游的海底区域比非旅游景点遭受更多的光营养活动，因此生物膜生长也更多。配备lambda扫描功能的光谱共焦显微镜已用于三维定位和分析在活的有机体内来自不同系统发育基团的个体生物的荧光签名（例如叶绿藻，胆固醇 - 植物，含有植物系的含有植物系的含有植物系，含有复杂的社区的荧光鉴定[7]．

在这项研究工作中，我们还评估了单色绿光(GL)，几乎不被光合生物使用，对光合生物的适应和生存能力，生物膜的结构，并最终，在通常用人工白光(WL)照明的海底环境中，其防止生物膜生长的效果。我们选择单色绿光，因为它为人类视觉提供了最大的灵敏度，从而保留了文化景点的细节和色调价值。

生物膜和照明系统
自然生物膜样品取自于地下遗迹（意大利罗马圣卡利斯图斯和多米提拉地下墓穴）的人工照明表面。样品保存在2mm厚的BG11培养基上[8在10%的营养浓度和1%琼脂凝固(默克)。人工生物膜是通过接种消毒石灰板，沉积在上述培养基上，1 g无菌培养Gloeothece membranacea (Rabenhorst) Bornet CCAP1430/3 (Pasteur Culture Collection, Paris, France)和绿藻小球藻(Chlorella sorokiniana Shih)。&来自西班牙塞维利亚Isla Cartuja Instituto Isla Cartuja (CSIC)文化收藏中心的克劳斯。将平板放置在培养皿中，并在19-22℃条件下保持连续绿光(GL) (Narva LT 18 W/017 green TT, Narva, Czech republic)或白光(WL) (Chiyoda f15 S daylight, Chiyoda Corporation, Japan)，光子通量密度为20µmol·m^–2 · s^–1使用LICOR Li-1800（美国东北林肯）分光辐射计测量每盏灯的发射光谱。

生物膜结构的可视化
共焦扫描激光显微镜（CSLM）是用徕卡进行的TCSSP2在荧光和反射模式下。反射模式(488 nm激发，480 - 490 nm发射)允许记录来自无机固体材料的反射信号。在590 ~ 800 nm的发射范围内，利用543 nm和633 nm的Ar/HeNe激光线在红色通道中观察到光合色素的自荧光。细胞外多糖(EPS)用凝集素Concanavalin-A-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Inc.， Eugene, OR, USA)标记(0.8 mM最终浓度)，并在绿色通道中观察(激发在488 nm线，发射在490到530 nm线)。核酸用dna选择性染料Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)进行特异性染色，并在蓝色通道中观察(激发在351和364 nm，发射在400到480 nm)。

我们获得的光学部分在沿着光轴不同的时间间隔（Z工序）获得的两个X-Y平面。图像呈现为使用了Imaris软件（位平面，苏黎世，瑞士）的多声道和3D投影。突起用来描述生物体的生物膜内的空间分布，以及在生物膜的厚度和结构的差异。

颜料荧光分析：Lambda扫描
根据Roldán等人（2004b）进行单细胞色素鉴定[7]．波长扫描使用488 nm的Ar激光线进行。每个图像序列(波长扫描)是通过使用20 nm的发射带宽扫描相同的x-y光学切片获得的。x-y-l数据集是在荧光最大的z位置获得的。在整个扫描过程中，每个字段的增益和偏移量都是相同的。

某一特定光谱分量的强度变化在屏幕上用假彩色标度表示(暖色代表最大强度，而冷色显示低强度)。x-y-l数据集的平均荧光强度(MFI)使用2.0版徕卡共聚焦软件进行测量。利用软件的感兴趣区域(ROI)函数，从扫描图像中确定选定区域的光谱特征。荧光分析中，1µm²在每个x-y-l图像堆栈中设置取自细胞内类囊体区域的图像。计算所有ROI的平均和标准误差。

来自罗马地下墓穴的生物膜
在自然或人工照明区域，形成生物膜的光养微生物大量生长在石膏、壁画、凝灰岩、砖或砂浆表面(图1a, 1b)。生物膜(图2)主要包括球菌和丝状蓝藻和苔藓，但也包括硅藻、真菌菌丝和放线菌[9]．根据自身荧光和EPS的三维投影图(图2)，生物膜通常多孔且厚度非常不均匀(从80 - 550µm)。对于大多数生物膜来说，上层的EPS最为丰富(图3a)。有趣的是，形态相似的光营养细胞对Con-A的反应随其在生物膜中的相对位置而变化。

通过将Hoechst 33258 DNA染色结果与色素自身荧光研究结果相结合，区分了活的光养和异养微生物。核酸染色未显示出广泛的异养细菌群落。但这些群落在光合色素荧光较弱的区域高度发育。反射通道显示无机硬基质的存在和厚度，如钙化鞘(图2c);与自身荧光结合，它能识别空的钙化鞘

人工生物膜
使用三维图像评估提交给GL或WL的艺术生物膜的结构和组合物的变化，由此光合颜料（PP）荧光红色和多糖结合的Con-A荧光绿色（图4）。两种GL和WL生物膜都分层（图4）。

GL：维持在GL下的平板包含由两到四个珠膜细胞组成的簇，被相对较厚的鞘包围，仅标记为Con-a至最古老的外层（图4a）膜囊藻液泡化类囊体被视为细胞内的空隙。索氏囊藻几乎不存在，少数剩余细胞具有微弱的色素荧光。

白光:白光下保存的平板显示出成群的膜acea与C. sorokiniana的亚球形细胞混合。与GL相比，这两种生物各自具有更高的色素荧光。膜藻有8至16个密集的细胞簇，有时进一步聚集并被明显紧密的鞘包围，被强烈标记(图4b)。在WL中生长的生物膜(图4b)比在GL中生长的生物膜(PP厚度= 4.65±0.9µm)更薄(PP厚度= 3.7±1.53µm)，包括致密的底层小而不规则密集的膜样G.，而C. sorokiniana生长在靠近表面的地方。

图4:GL和WL下生长的蓝藻生物膜的共聚焦投影。颜色键:PP，红色;每股收益、绿色;NA,蓝色。a. GL中生长的Gloeothece membranacea菌落，鞘不致密，仅在外层有Con-A凝集素标记(箭头)。b. G.膜acea菌落在白光生长。细胞密集排列，最多可达16个细胞，被紧密的鞘包围(箭头)。小球藻主要分布在上层。T =生物膜表面。标尺= 10µm。

来自罗马地下墓穴的生物膜
分层生物膜的扩展聚焦图像显示在生物膜的微生物的深度（图5）的差异分布。对于每一个生物膜，在488nm激发相应的发射光谱波长显示在右边（图5b）。

生物膜BF1：细丝Leptolyngya SP的。被水平定向上宽伪枝藻julianum（图5a）的顶部上。既从蓝藻叶绿素a和藻胆，藻青素（PC）和别藻蓝蛋白（APC）（图5b）的重叠曾在658.4±3nm的宽的发射峰。此外，Leptolyngybya属，但不是S. julianum，呈现的发射峰（579.7±3.8 nm）的归属于藻红蛋白（PE）的存在下（图5b）。我们没有看到来自同一类群尤其标本的发射峰值的变化（例如伪枝藻julianum时厚鞘，EPS或钙质投资覆盖）。

生物膜BF2:CSLM显示出两层。鸡冠藻-硅藻门-主要集中在生物膜的顶部（图5a）。由于叶绿素c的存在，其最大值为676.2±5 nm（图5b），与其他组的发射峰不一致。

未识别Chroo-球菌形成的不连续底层（图5a）和呈现相同的光谱形状Leptolyngybya藻。（BF1）。蓝藻的范围呈现较高的平均荧光强度（MFI）从640到比没有Bacillario-phyta（图5b）740纳米。蓝藻也呈现高MFI在577至580nm（图5），由于PE。

图5：CSLM突起和从罗马墓穴2个aerophytic生物膜的荧光性质。一种。每个图像表示范围590-775纳米发射的自发荧光（激发波长= 543纳米）。BF1。由伪枝藻julianum和Leptolyngbya SP形成生物薄膜。BF2。分层生物膜，由两个地层，Diadesmis高卢的菌落构成的上层侧层石生，并且通过Chroococcal菌落形成的下层。湾从拉姆达扫描每个物种的单电池（激发波长= 488纳米，步骤= 50）的光谱分布。生物膜的发射分布之间的差异表明藻类和蓝藻的不同基团的存在。 T= Biofilm surface. Scale bar = 10 µm (published in: Applied Environmental Microbiology 70 (2004) 3745–3750).

人工生物膜
在488 nm的激发波长下，GL和WL的MFI和半带宽度不同，但光谱形状相同(图6)。

Gloeothece membranacea：对于GL样品，将最高的最大对应于叶绿素a（约670.7纳米），而对于WL样品的发射谱带相当高（659.3到666.4纳米），对应于藻胆蛋白的PC和APC（图6b）。在这两种GL和WL，G. membranacea表明PE荧光在约的发光波长580纳米时在488nm处激发。在GL，峰值位置密切主光系统II（PSII）发射峰在685纳米相匹配，具有接近730nm的最大次要对应于光系统I（PSI）的发射带（图6b）。被发现为573.6到590.7纳米范围内发射，其中发射PE，和653.6到659.3纳米，其中PC和APC EMIT GL和WL处理的样品的MFI之间显著差异。我们可以假设，GL影响通过降低荧光净率荧光性质。

sorokiniana小球藻：在488 nm激发波长下，两种处理的样品均未观察到Chl a最大值的显著差异（图7）。

图6：不同光质（GL和WL）照射后，膜囊单细胞的荧光特性。a.对应于叶绿素a和藻胆蛋白发射峰的lambda扫描（激发波长=488 nm，步长=50）光学切片（PE，藻红蛋白；PC，藻蓝蛋白；APC，别藻蓝蛋白）。b.光谱剖面，表示GL和WL下膜藻的平均荧光强度光谱。比例尺=10µm（发表于：应用环境微生物学72（2006）3026–3031）。

图7:不同光质量(GL和WL)照射后小球藻单细胞的荧光特性。a.对应叶绿素发射峰的λ扫描(激发波长= 488 nm，步长= 50)的光学切片。b.光谱剖面表示小球藻在GL和WL下的平均荧光强度光谱。与白光对照相比，GL处理后的色素平均荧光强度降低。尺度条= 10µm(发表于:应用环境微生物学72(2006)3026-3031)。

生物与生物膜结构
CSLM是研究微生物分布及其生物降解效应的一项优秀技术[10.]。它已被用于成像各种栖息地、地下墓穴中的光营养生物膜和垫[9]等的昏暗aerophytic环境如落水洞和洞穴[11.].对于生物膜样品，在不同焦深处使用多个激发和检测波长使我们能够三维可视化目标特定元素，如分子（如DNA和色素）、结构（如表面、基质、鞘和丝）和性质（如细胞分裂、生长和衰老阶段）。

颜料
到目前为止，具有λ扫描功能的CSLM仅用于确定新的或已知的荧光染料的发射光谱的最佳检测和分离。在本研究中，我们使用带有lambda扫描的CSLM创建了一个功能强大的工具，具有广泛的应用范围。荧光检测可以根据生理状态来描述一个复杂的群落[12]及生物量的量化[13]．叶绿素是在大多数植物，藻类和蓝藻找到了光合色素。此外，大多数蓝藻藻胆蛋白的使用（藻红蛋白，藻蓝蛋白和别）来捕获光能。使用lambda扫描功能，属于一个系统发生组物种表现出分光光度曲线在从其他系统发生基团的形状和颜料发射峰区分[7]该技术的主要特点是：（i）分析全局和单个荧光像素，提供其在体内的三维定位；（ii）直接分析厚样品中单个细胞的荧光色素，无需隔离；（iii）在荧光性质、形态和复杂微生物组件内的位置之间建立同步关系；和（iv）区分菌落内具有特定荧光特征的细胞，以及与单个细胞状态的相关性。

防止生物退化的方法
从艺术作品中消除微生物殖民并非易事。大多数去除光养生物膜的处理方法包括施用杀菌剂，这往往会产生不良的效果。因此，迫切需要替代的、低风险的方法[14]．我们认为控制生物恶化的关键是采取措施防止微生物群的有利生长条件。我们的结果表明，使用单色的GL，这是很不容易被大多数光合生物吸收，是有用的，以防止绿色的环境。只有一些蓝藻细菌能够获得足够的光能，在极端昏暗的环境光或GL中生存[6虽然它们没有茁壮成长[15]．这表明，与照明GL代替WL hypogean环境可以减少苔藓和藻类物种的多样性。

有必要进一步发展技术，以监测光营养生物膜生长的自然条件，并评估预防或根除治疗对生物膜的定性和定量变化。CSLM有利于保护文化遗产遗址，因为它允许在体内探索非常小的样本（例如珍贵艺术品样本），并提供实时和空间信息。该方法与白光激光或荧光寿命成像显微镜等新技术相结合(飞行） ［16创造了关于光合微生物的广泛新实验的潜力。此外，光谱CSLM使我们能够识别特定波长的光合微生物所使用的色素[15日17].我们目前正在利用这些信息为文化遗产受威胁的遗址开发照明替代方案。

我们感谢奥利瓦博士对统计计算的贡献。这项工作得到了欧盟能源、环境和可持续发展计划(EU Energy, Environment and Sustainable Development Program)在cat项目(合同EVK4-CT-2000-00028)框架内的部分支持。

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