CARS显微镜:分子的成像特征振动对比

分子中的化学键可以摇动、弯曲和嘎嘎作响。它们以特定的速度或频率运动。这些频率是如此的特殊，以至于我们可以通过调整它们特定的振动频率来确定是哪种化学键发出了震动。例如，许多有机分子包含碳和氢原子之间的键，因此它们有碳氢振动运动。更重要的是，碳氢键的振动频率与其他化学键的振动运动非常不同，比如氧氢键。换句话说，通过检测一个分子的振动频率，我们可以对这个分子的化学结构有一些重要的了解。因此，振动分析相当于化学分析。

其中一些振动运动可以通过光检测分子来解决。不幸的是，分子振动的频率远低于可见光波的振动频率。这意味着我们不能用普通的光源，包括作为光学显微镜一部分的激光，直接调节这些分子运动。然而，分子可以用间接的方法检测。拉曼光谱就是这种间接检测的一个例子[1］．在拉曼光谱和显微镜下，分析了传统的激光束地址样品，分析了分子散射的光。与激发光相比不同颜色的散射光可能包含关于分子振动的信息。这种方法看起来非常类似于荧光测量，但收集的信息非常不同。在拉曼光谱中，激光频率与拉曼散射光之间的差异对应于化学键的频率。使用适当的过滤器和光谱仪，可以自信地在光学显微镜中收集拉曼散射光，从而收集有关样品的化学信息。这提供了独特的可能性。由于几乎每个分子表现出特殊的化学键振动，即拉曼活性，因此可以在不需要任何外本标记的情况下产生样品的化学图。毫不奇怪，这种能力引发了许多研究学科的兴趣，包括材料合成，法医研究，矿物学，毒理学以及艺术品的化学分析[2］．

拉曼光谱和显微术也对生物学产生了影响。拉曼显微镜能够以无标记的方式研究细胞和组织，这为研究难以染色或为标准光学检查准备的生物样本打开了机会。例如，拉曼光谱已经被证明足够敏感，可以捕捉到健康和癌变组织化学组成的细微差别。尽管拉曼显微镜在生物学研究中具有巨大的潜力，但它还没有完全成熟成为生物实验室的常规成像技术。拉曼显微镜在组织和细胞研究中影响有限的原因是拉曼信号本身的弱点。信号很弱，因为拉曼效应间接探测分子:激光与分子振动不共振。拉曼效应是可以测量的，但是与荧光相比，它是一种非常微弱的效应。这意味着记录拉曼图像要比记录荧光图像花费更长的时间。大多数荧光图像可以在一秒钟内拍摄，而相同维度的拉曼图像则需要一个小时或更长时间。显然，这样的图像采集时间对于生物成像应用来说不是很有吸引力。

这是否意味着拉曼显微镜在快速生物成像领域没有未来?幸运的是，有替代的拉曼技术可以显著提高信号水平。非线性喇曼技术利用超快脉冲激光器，更有效地探测分子的振动响应。物理上，非线性拉曼技术使分子一致振动，产生相干信号，与传统的拉曼光谱相比，可高出5个数量级。有几种非线性喇曼技术，如相干反斯托克斯喇曼散射(汽车)和受激拉曼散射(SRS)，它们都探测相同的拉曼活性分子振动[3.］．这些技术并不是新的:非线性拉曼方法的许多基础是在20世纪60年代奠定的。在非线性拉曼方法家族中，汽车是生长到用户友好的显微镜工具的第一种方法。首先汽车显微镜日期返回1982年，但是第一个有用的生物实施在十年前展示了一点，1999年[4.］．从那时起,汽车显微镜技术已经成熟为一个易于使用的成像工具，强调了徕卡的发布TCS汽车显微镜，它增加了实时振动对比的调色板的光学显微镜。的汽车成像方式提供的图像像预期的共聚焦荧光显微镜一样快速和清晰。有了这样的成像能力，一个全新的成像应用领域就触手可及。

什么是应用范围汽车显微镜吗?的汽车显微镜在脂质成像面积上已经产生了重大影响[5.］．通过调整成对称CH可以可视化脂质₂脂肪族分子的伸缩振动。为例子,汽车显微镜可以区分饱和和不饱和脂质，可以选择性地检测胆固醇和胆固醇酯，可以揭示脂质膜的堆积密度信息。的汽车显微镜具有足够的灵敏度，可以接收单个磷脂膜的信号，使膜生物物理学、囊泡运输和细胞器定位的研究成为可能。强烈的汽车来自脂质的信号还促使了脂质代谢的研究，贩运细胞内脂质体，并研究了脂质积累与肿瘤生长之间的相关性。最重要的是，强烈的汽车来自富含脂质的髓磷脂的信号在神经退化疾病的进展和治疗中揭示了一些重要的见解。

另一个有趣的振动反应是蛋白质的振动反应。虽然汽车显微镜无法在蛋白质中辨别鉴别，可以产生蛋白质密度的地图[6.］．CH的_3.甲基拉伸振动为绘制组织和细胞中的蛋白质分布提供了一个方便的处理方法。在病变组织中，蛋白质密度的空间分布往往是重要的标志。

汽车显微镜也被用作监测生物和合成系统中的水动力学的首选方法[7.］．O-H拉伸振动为组织中的水提供了一种敏感探头。除了所设计的微结构材料中的水动力学之外，这使得单细胞和细胞器中的水渗透性能够研究。

无标签和非侵入性的特征汽车显微镜通过皮肤使技术非常适合监测局部施加的化学品的渗透在活的有机体内。汽车已被用来遵循动物模型中矿物油的扩散[8.];一种最近也被证明对人类患者皮肤起作用的方法[9.］．

除了组织和细胞的无标记化学成像，汽车利用显微镜观察了聚合物薄膜的化学组成和制备的微结构。对比可以从聚合物中碳网络的振动运动或有机分子中的羰基中得到。的汽车来自许多聚合物结构的信号足够强，可以用于成像目的而进入各种各样的振动拉曼信号。此外,汽车显微镜可以探测具有强吸收特性的分子体系。例如，碳纳米管可以单独在汽车显微镜。类似地，半导体纳米粒子，如硅和氧化铁的纳米结构，可以根据其非线性逐个可视化汽车反应(10.］．重要的是,汽车来自这些纳米粒子的信号不受光漂白的影响，这保证了在不褪色的情况下持续成像。这些示例说明了具有广泛的成像应用汽车材料科学中的显微镜。

与荧光显微镜相比，非线性拉曼显微镜相对年轻。尽管如此，非线性拉曼技术的影响已经清晰可见，特别是在生物组织的无标记成像领域。与荧光技术相比，基于振动对比快速生成图像的能力为光学显微镜现有的对比机制增加了一个新的维度。的商业可用性汽车成像模态为显微镜送去更多选项来检查照明样品的微观细节。新对比度具有新的发现。看看如何像技术如何令人兴奋汽车显微镜可以扩大我们对微观世界的理解。

一步一步指导CARS显微镜的分子基础

1. 一种新型的二次辐射。自然121(1928)501-502。
2. Turrell G和Corset J（EDS）：拉曼显微镜。发展和应用。学术出版社，圣地亚哥（1996年）。
3. Min W，Freudiger CW，Lu S和Xie Xs：相干非线性光学显微镜：超出荧光显微镜。安努。rev. phys。化学。62（2011）507-530。
4. ZUMBUSCH A，HOLTOM G和XIE XS：使用相干反斯托克斯拉曼散射的振动显微镜。物理。rev. lett。82（1999）4142-4145。
5. Le TT，悦斯和程JX：用连贯的防斯托克斯拉曼散射显微镜脱落新光。J. Lipid Res。51（2010）3091-3102。
6. Benalcazar WA和Boppart SA:非线性干涉振动成像用于皮肤中分子域的fas无标记可视化。肛交。Bioanal。化学。400(2011)2817-2825。
7. Potma EO, d Boeij WP, v Haastert PJM and Wiersma DA:实时可视化细胞内流体动力学。Proc。国家的。学会科学。美国98(2001)1577-1582。
8. Evans CL, Potma EO, Puoris'haag M, Cote D, Lin C, Xie XS:组织化学成像在活的有机体内通过视频速率相干反斯托克斯拉曼散射（汽车）显微镜。Proc。国家的。学会科学。美国102（2005）16807-16812。
9. Breunig HG, Bückle R, Kellner-Höfer M, Weinigel M, ladman J, Sterry W和König K:健康和疾病影响的人类皮肤的体内多光子和CARS成像。Microsc。中欧>,那DOI: 10.1002/jemt.21082 (2011).
10. 王Y，Lin Cy，Nikolaenko A，Raghunathan V和Potma EO：纳米结构的四波混合显微镜。adv。选择。光子。3（2011）1-52。