真共焦扫描照明模式
真正的共焦成像需要一次在一个点上进行照明和观察。为了创建二维图像，需要在要成像的区域上扫描该点。扫描通常由两个可以在x和y方向上指向光斑的镜子执行。与其他扫描系统（如光栅电子显微镜或20th从左到右(x方向)扫描点，从上到下(y方向)扫描帧。
样品中的某个位置(例如荧光染料的位置)，每次光束移动到该位置时，都会经历一个光脉冲。这个点是理想的airy形状。光照持续时间，即时间τP它取决于波长和NA，取决于样品的实际扫描速度和衍射图案穿过位置的高度。衍射图案通常比荧光颜料大得多(150…1000 nm vs. 2…20 nm)。
对于任何扫描的图像，荧光染料都会经历如图1所示的照明脉冲模式。由于过采样，照明间隔时间为1/fl, fl线路频率。在真正的共聚焦显微镜中，典型的线频率在1 kHz左右，但可能在10 Hz到2 kHz之间。
对于每一个记录的图像，氟铬将经历如上所述的照明脉冲模式。脉冲模式之间的时间由图像重复时间1/f控制F，或者是受扫描速度限制(通常称为“帧每秒”fps)，或者是故意延长，这在生理学的延时实验中是典型的。fF帧频率。
(评论:为了模拟，我们可以假设矩形脉冲每帧只穿过一次。后一种假设与过采样的要求相矛盾(奈奎斯特-香农)，但主要不干涉三重累积的影响)。
三重态，荧光暗态
在适当颜色的光(光子能量)照射下，荧光色素可以吸收光子并从基态G过渡到激发态e。在分子中，这些状态显示出一系列的子态(振动态)。当被激发到这些振动态之一时，分子将迅速弛豫到最低的亚态(在低温下，例如室温)。从激发态，分子会回到基态。激发态的典型剩余时间取决于分子的电子系统，称为“荧光寿命”。激发态指数衰减到基态。在适当的条件下，衰变由其他光子触发。这种现象称为受激辐射(见发生的超分辨率显微术)。当跃迁到基态时，能量通过光子发射而释放。在常见的荧光过程(自发发射)中，由于振动能量的差异，发射光子的能量小于激发光子的能量。因此，有一个从较短波长(激发)到较长波长(发射)的Stokes位移。
根据分子的不同，激发态也有可能被耗尽的其他途径。最突出的非荧光方式之一是所谓的“系统间交叉”，ISC。在这里，分子进入一个在能量上介于E和g之间的状态，由于量子力学的原因，这个状态被称为“三重态”T，从这里到基态的衰变非常缓慢。因此，分子在一段时间内处于三重态。还有其他的状态，其中荧光色素是不荧光的，特别是最重要的荧光蛋白显示各种各样的“暗态”，不一定是三重态。这里报告的荧光产率的发现也适用于非三态暗态。不可逆的氟铬破坏(漂白)可能需要不同的论证。
讨论了三重态作为漂白的主要来源之一。特别是激发态的三重态往往与分子的化学破坏有关。在模拟中，为了简单起见，我们可以假设所有在三重态中吸收额外光子的荧光色素都将被不可逆地破坏(漂白)。
低剂量率:少生三胞胎
有了扫描图像中的脉冲照明和涉及三重态(这是标准荧光色素中最常见的)的荧光过程的概念，我们现在可以理解快速真正的共聚焦扫描系统(与低速扫描仪相比)的发现，当使用共振扫描系统时，荧光信号更好，白化更少。
如果不存在三联体，荧光光子的数量将取决于照明强度和荧光团的量子产率。当照明打开时，发射将增加（增加的速度取决于荧光寿命），并保持在恒定水平。一旦我们允许一些受激分子移到三重态，它们就不再能够产生荧光光子。因此，排放量将减少。我们甚至可以假设所有分子都处于三重态的情况，只有在非常偶然的情况下，当三重态松弛到基态时，荧光机制可以工作一小会儿，发射一些光子，并在分子经历系统间跃迁并在三重态保持黑暗时停止。这种极端情况是现代超分辨率技术的基础：基态耗尽（GSD）。但即使在不太极端的条件下，三重态也会减少准备发射的荧光色素的数量。从T到G的弛豫很慢（取决于分子的量子参数）。
如果我们停止照明，荧光会减少(显示实际荧光衰减时间)。慢慢地，以更慢的速度，三重态分子也会回到基态，当它们准备再次产生荧光时。显然，无论我们是试图在单一的长光照(三重态降低了强度)中获得辐射，还是在两个较小的剂量之间有一段时间放松(仍然假设总光照剂量是恒定的!)如果后一种情况下的中断在三重态弛豫(R)的范围内或更长的范围内，我们将在最后收集更多的光子。这与同等照明剂量下更明亮的成像是相同的。
避免三态有一个额外的好处:样本漂白得更少。正如所指出的，漂白的很大一部分是由于三重态的激发。如果我们能避免这些状态的积累，分子光化学分解的风险就会降低。
- 低线频率会增加照明脉冲之间的恢复时间，但也会增加照明脉冲时间，因为光斑在样品上的移动速度较慢。通常，这种较慢的移动会增加三重态浓度。只有非常低的强度才能避免这种影响。
- 高线频率缩短了照明脉冲之间的时间，增加了三重波的积累。另一方面，每个脉冲的照明时间更短，因此积累的三波更少。
- 如果将相同剂量的光以小剂量施加，通过将频率乘以n次并累积或平均n次，如果衰减时间不明显长于脉冲之间的间断，则总荧光将增加。在这里，共振扫描器是最有益的。
- 如果三重态衰减比线频率慢，隔行过采样将改善信号。在这里，后续帧从其他重叠行收集信息。例如，每5分钟进行一次扫描th线,2nd扫描每5th+1行…等等。在这种情况下，照明脉冲之间三重态恢复的允许时间由帧频f决定F．
- 在任何情况下，建议使用短的照明脉冲，即快速线路频率。因此，谐振扫描系统(目前，光电扫描设备提供高达20千赫)是改善信号噪声和减少光漂白和光毒性的一般选择。
