第三届欧洲超分辨率用户俱乐部会议摘要

阿尔贝托·阿斯特普罗，意大利理工学院，热那亚，意大利

众所周知，对于光学显微镜中最流行的成像模式荧光，衍射障碍不再是分辨率和定位精度的不可逾越的限制。此外，术语“超分辨率”和早期创造的“光学纳米显微镜”已经在真正的远场光学显微镜中实现，现在每个人都可以使用，而且没有极端的复杂性。由于提高分辨率的新因素是使用荧光分子，而它的光物理学有时与样品有关，所以我们决定从不同的方面来解决这个问题。

由于这个原因，我们实现和适应了一些不同的光学荧光设置，以达到超分辨率。在考虑超分辨率方法时，我们还考虑了它们对成像厚(>50 um)的实现。
生物标本。在基于单分子定位的随机读出方法框架内，我们在选择性平面照明显微镜（SPIM）架构内实现了单个分子定位（IML），以解决3D超分辨率成像问题。

将介绍与哺乳动物细胞球体相关的应用。最近，同一系统已被赋予使用双光子光激活执行IML-SPIM的可能性。此外，将提出一种光学解决方案，以克服SPIM将样品插入圆柱形样品架的要求。在e有针对性的读取方法，如发生的，我们引入了双光子激发，包括使用单一波长(SW)的可能性双光子激发和发生的通过实现一个SW-2体育-发生的显微镜。自发生的在不需要计算工具的情况下，我们将该方法扩展到直接写入光刻和多模超分辨率显微镜。将概述超分辨率直接写入光刻，以证明利用发生的式机制。另一方面，在多模态超分辨率显微镜方面，我们将展示耦合发生的原子力显微镜。这使我们能够更精确和具体地处理AFM并通过尖端-粒子相互作用以积极的方式使用它。到目前为止，将针对需要纳米级研究的特定应用概述各种体系结构。

这一方面特别符合多学科IIT科学环境：从神经科学到药物发现和交付，从智能材料到计算成像等等。

Ilaria Testa，马克斯·普朗克生物物理化学研究所，纳米生物光子学系，德国哥廷根

基于透镜的荧光显微镜，长期以来被衍射限制在分辨率>200纳米的范围内，正在迅速发展成为一种纳米级成像技术。在这里，我们表明，新兴的共振荧光显微镜能够快速、连续地对活体脑组织中敏感的纳米级特征进行成像。使用低强度照明为了在荧光开启状态和非荧光关闭状态之间可逆地切换光致变色荧光蛋白，我们获得了比共聚焦显微镜在所有三个空间维度上增加3倍以上的结果没有退化的迹象。

使用快速切换的荧光蛋白使成像速度比已报道的RESOLFT方案提高了50倍，这反过来使我们能够记录自发和受刺激的树突肌动蛋白丝和脊柱形态在秒到小时的时间尺度上发生的变化。

西尔维奥·里佐利，欧洲神经科学研究所，Göttingen，德国

细胞间的物质交换依赖于供体小室中装载货物的小泡的形成及其随后向受体小室的传递。这些过程涉及大量蛋白质辅因子，其功能众所周知，并且在不同途径之间保持不变。然而，定量组织在任何膜转运途径中都还没有辅因子的表达。我们在这里分析了维持神经元传递的突触囊泡循环途径。我们测量了绝对拷贝数，并估计了60种蛋白质的位置，这些蛋白质占该途径中蛋白质的40%以上。我们还测量了突触囊泡循环c形态学，这些数据使我们能够生成一个突触模型，该模型也考虑了蛋白质结构。最后，我们还估计了另外1140种蛋白质的丰度。突触囊泡循环主要由参与货物运输的蛋白质控制。负责从acce中回收囊泡成分的辅因子ptor室（质膜）不太丰富，可能是突触功能的瓶颈。

Giuseppe Vicidomini，意大利热那亚意大利理工学院

受激发射损耗(发生的)显微镜通过减少有效收集荧光信号的体积的空间延伸达到亚衍射空间分辨率。为此，它采用了一个规则的激励光束与一个圆环形光束共同对准。第二束的作用（通常称为发生的光束）是指（通过受激发射）瞬态猝灭聚焦激发区中的所有荧光团，但位于圆环中心附近的荧光团除外，其中发生的光束强度几乎为零。只有当发生的光束足够强烈，荧光区域能达到远低于衍射极限的大小。从理论上讲,发生的显微镜可以接近“无限”的空间分辨率，但代价非常高发生的光束强度。实际上，可能的光损伤和光毒性效应限制了辐射的数量发生的可以聚焦在样品上的光束强度，因此，最终分辨率为发生的显微镜。

最近，已经证明，通过使用时间门控检测，有可能显著降低强度的需求发生的不损失空间分辨率的光束。减少发生的光束强度不仅对活细胞成像有很大的影响，而且激发了有效实现的可能性发生的显微镜与发生的以连续模式工作的波束(连续波)，从而大大降低成本和复杂性发生的显微镜。这个实现通常被称为gCW-发生的显微镜。

我们首先分析了gCW的基本原理和局限性-发生的技术。封闭的连续波-发生的显微镜本质上（仅）受到与选通相关的信号减少的限制。信号减少转化为图像的信噪比（SNR）和背景比（SBR）降低，这可能限制系统的有效分辨率。

因此，我们提出了基于硬件和软件的方法来提高gCW-的信噪比和SBR发生的最后，我们展示了这些方法的协同作用导致了一个多功能的gCW-发生的实现能够达到50 nm以下的空间分辨率与剂量发生的光束的亮度低于100兆瓦。

拉尔夫·雅各布(Ralf Jacob)， Philipps-Universität马尔堡，德国

上皮细胞的质膜分为两个独立的膜室，顶端和基底外侧。这种极性是由细胞内机制维持的，这种机制引导新合成的物质进入正确的目标膜［1］. 此外，糖蛋白和脂质可以进入不同的途径进行顶端或基底外侧传递。为了发现这些途径并揭示高尔基体后内体顶端运输的复杂网络，采用了生物化学和显微镜相结合的方法。
顶端分选受体galectin-3的靶向性研究[2]，通过表观荧光显示，蒂尔夫——GSD-microscopy。在这里，我们可以显示凝集素循环之间的质膜和内体细胞器。

细胞内运输是由微管作为细胞内运输通道来维持的。这些轨迹的翻译后修饰是正确地传递到根尖质膜所必需的。高分辨率gsd成像显示了这些修饰沿着单个微管的分布[3].

Eric Hosy，法国波尔多大学国家科学研究中心研究员

在中枢神经系统中，绝大多数突触使用谷氨酸作为神经递质，突触传递强度与突触谷氨酸释放位点下谷氨酸受体(AMPA型)的数量成正比。许多研究报道了AMPA受体的数量、组织或组成的改变，以响应各种生理刺激，这是突触成熟和可塑性，记忆，疾病等基础。然而，由于光学显微镜的指向精度有限，现有的光学工具并不能精确地描述受体的基本组织。超分辨率技术的出现打破了这一限制，使我们能够理解AMPA受体的组织，以及作为其在突触内定位功能的流动性变化。

这里我们使用了不同的超分辨率技术(GS-DIM，发生的,棕榈和U-PAINT）广泛研究突触内AMPAR的组织和流动性，我们发现AMPA受体并非随机分布在突触内，甚至PSD内，而是在约80nm的纳米域中结构。这种分布允许维持突触反应的高保真度。同时，PSD的主要支架蛋白之一PSD95的扰动影响AMPAR的动态组织和相同范围内的突触电流。

Colin Sheppard，意大利理工学院，热那亚，意大利

回顾了实现超分辨率的不同方法。首先，我们讨论了分辨率的不同定义。特别是，我们说的通常称为分辨率，但不是真正的分辨率。分析了超分辨率背后的基本原理，并对不同的方案进行了分类。我们定义了三个不同的类别，分别是imes称为超分辨率，其中之一是真实的、不受限制的超分辨率。根据Lukosz的说法，基本上，分辨率不受限制，而是光学仪器传输信息的能力。根据这一原理，可以通过权衡物体的其他一些特性或使用一些关于对象的先验信息。

Hell解释说真正的超分辨率是基于切换的特性。然而，其他人认为这是不必要的限制，非线性是必要条件，而切换只是一个特殊情况。地狱还指出发生的是一种远场技术。虽然这在某种意义上可能是正确的，但似乎一般荧光本身可以被视为一个近场过程，即荧光分子本身在近场与光相互作用。也许这只是语义学，或者也许这是一种原则，可以让我们了解哪些方案不能形成超分辨率的基础。