第二届欧洲超级分辨率用户俱乐部会议的摘要

Hjalmar Brismar，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所生命科学实验室

生命科学实验室（SciLifeLab）是大规模生物和医学研究的国家基础设施，重点关注基因组学、蛋白质组学、生物成像和生物信息学。SciLifeLab由斯德哥尔摩和乌普萨拉的四所大学合作创建，并于2010年成立。188bet怎么注册该中心结合了先进的技术诀窍和最先进的设备在转化医学和技术驱动的分子生物科学方面拥有广泛的知识基础。

愿景是使SciLifeLab成为高通量生物科学的竞争中心——专注于大规模DNA测序、表达分析、蛋白质分析、细胞分析、生物成像、高级生物信息学和系统生物学[1.].SciLifeLab计划涵盖四所大学和两个地点，一个在斯德哥尔摩，一个在乌普萨拉。瑞典政府的战略研究拨款使这项研究成为可能。

斯德哥尔摩网站，包括卡罗琳斯卡学院、KTH皇家理工学院和斯德哥尔摩大学，围绕四个技术平台建设；基因组学、蛋白质组学、生物信息学和生物成像。该实验室位于卡罗琳斯卡学院校园内。目前约有300名研究人员活跃在斯德哥尔摩现场。2013年，该中心将有更多可用空间，另有350名研究人员将迁入该中心。

基因组学平台基于高容量的下一代DNA测序，其吞吐量相当于每年数百个完整的人类基因组。该蛋白质组学平台包括质谱分析、基于抗体的蛋白质分析以及化学库和siRNA技术的自动筛选。

基因组学和蛋白质组学平台由具有先进光学显微镜设备的生物成像平台补充，包括受激发射损耗以及其他类型的超分辨率显微镜。sciiliflab和人类蛋白质图谱项目之间已经建立了战略合作关系^2.它提供了世界上最大的针对人类蛋白质的抗体集合之一(目前针对50%的人类蛋白质)。sciliifelab正在许多大型项目中使用这些抗体，例如绘制人类蛋白质的亚细胞定位图。

Stefan W.Hell，马克斯·普朗克生物物理化学研究所，德国哥廷根

在里面受激发射损耗显微镜[1.]，荧光特征被关闭受激发射损耗光束，它将荧光团限制在基态，在焦点区域的所有地方，除了亚衍射区域的范围

λ/(2na√[I + I_年代]).

在再吸收显微术中[2,3的原则受激发射损耗已扩展到低强度荧光开关我，通过诉诸分子开关机制，需要低开关阈值我_年代．一个我_年代通过可逆地将荧光团转换为长寿命的暗(三重态)态，可降低许多数量级[2–4或介于长寿命的“荧光激活”和“失活”状态之间[2.5.]．这些可选的转换机制需要一个我_年代这比过去低了几个数量级受激发射损耗.在成像应用中，受激发射损耗/RESOLFT能够对活细胞、组织甚至活动物进行快速记录和应用[6， 7]．

从纳米复制的基本原理开始，我们将讨论最近的发展[8, 9]，并特别关注RESOLFT和最近活体老鼠大脑的纳米级成像[7.),受激发射损耗．

阅读更多关于“的信息”来自小鼠大脑的清晰实时图像"

Christian Eggeling, Veronika Mueller, Alf Honigmann, Giuseppe Vicidomini, Gael Moneron, Haisen Ta, Stefan W. Hell

圣利用E使命D完成(受激发射损耗)远场显微镜允许以纳米级分辨率研究活细胞，否则受到传统显微镜有限的空间分辨率的阻碍[1.]．除了图像的记录，组合受激发射损耗使用单分子灵敏的光谱工具，如荧光相关光谱(未来作战系统)揭示了隐藏在常规观测中的复杂动力学过程[2–4]．例如,受激发射损耗-未来作战系统报价新的见解重要的细胞过程，如脂质的脂质，lipidprotein相互作用或所谓的“脂质筏”的在蜂窝质膜的形成[4 - 9日]．改进的洞察力是通过实现门控检测或记录实现的受激发射损耗-未来作战系统扫描期间的数据[10 - 12]．

Anna Szymborska，Alex de Marco，Volker Cordes，John Briggs和Jan Ellenberg；EMBL，细胞生物学和生物物理学，德国海德堡

将单个蛋白质的原子结构整合到多蛋白质组装的大分子模型中，是理解细胞机械机制细节和功能的长期挑战。最突出的例子之一是核孔复合体(NPC)，一个由几百个多肽组成的~ 100mda组装体，在所有真核生物中作为核浆运输的唯一通道。低温电子断层扫描提供了NPC的整体结构，但由于技术上的限制，其分辨率不能明确地绘制组装中单个亚配合物或单个核孔的原子结构的位置、化学计量和方向。因此，单个分子如何组成核孔仍然是一个悬而未决的问题。

这里，我们使用了超分辨率（SR）用光学显微镜研究人类培养细胞中NPC的亚结构。我们最初专注于Nup107–160复合体的组织，它是脊椎动物NPC支架的主要组成部分，负责稳定高度弯曲的孔膜。我们克服了生物细胞中SR的典型分辨率限制通过将其与数千个孔的单粒子平均值相结合，测量了约20 nm的pecimen，并以1 nm的精度测量了Nup107–160组分与孔中心8倍对称轴之间的距离。我们对NPC支架的组织结构获得了新的结构洞察，并证明结构生物学问题可以用光学显微镜检查。

Alberto Diaspro，意大利热那亚意大利技术研究院纳米物理系和意大利热那亚大学物理系

众所周知，对于光学显微镜中最流行的成像模式，即荧光;衍射势垒不再是分辨率和定位精度的不可逾越的限制。此外，早期创造的术语“超分辨率”和“光学纳米显微镜”已经在实际的远场光学显微镜中实现，现在每个人都可以使用，没有极端的复杂性。在这里，我们将讨论使用单光子和多光子激励的目标和随机读出方法，在分辨率和定位精度方面。在选择平面照明显微镜(SPIM)中实现的个体分子定位(IML)将用于厚生物样品的三维超分辨率成像。受激发射损耗双光子激发显微镜将讨论报道使用单一波长(SW)的可能性双光子激发和受激发射损耗通过实现软件来消耗-2体育-受激发射损耗显微镜。另一个主题将与受激发射损耗和原子力显微镜。到目前为止，各种体系结构将在考虑到苛刻的纳米级调查特定的应用进行概述。

Eric Hosy，波尔多大学，法国国家科学研究院

中枢神经系统中的大多数突触使用谷氨酸作为神经递质，突触传递的强度与谷氨酸受体（AMPA型）的数量成正比存在于突触谷氨酸释放位点下。许多研究报告了AMPA受体数量、组织或组成的改变，以响应各种生理刺激，这些刺激是突触成熟和可塑性、记忆、疾病等的基础。然而，现有的光学工具并没有精确描述基本的AMPA受体由于光学显微镜的指向精度有限，受体的组织。超分辨率技术的出现打破了这一限制性障碍，使我们能够了解AMPA受体的组织，以及作为其在突触内定位功能的移动性变化。

这里我们使用了3种不同的超分辨率技术(受激发射损耗,棕榈和U-PAINT）广泛研究的组织和AMPAR的突触内的流动性，我们发现，AMPA受体不是随机分布的突触甚至PSD内，但在约80纳米的纳米域结构。这种分布允许维持突触响应的高保真度。并行地，PSD，PSD95的主支架蛋白中的一个的扰动，在同一范围内影响AMPAR和突触电流的动态组织。

朱塞佩Vicidomini，纳米物理，因诺琴蒂基金会意大利语迪TECNOLOGIA，热那亚，意大利

通过使相邻特征（接近光波长的一半，即200至300 nm）在时间上连续发出荧光，受激发射损耗(受激发射损耗)显微镜和其他新兴的超分辨率技术现在已经基本上克服了衍射障碍。在里面受激发射损耗在显微镜下，荧光特征的顺序探测是通过限制荧光发生的体积的空间范围来实现的。实际上，受激发射剥夺了激发区外部的荧光分子的荧光能力。因为受激发射跃迁必须与对于自发辐射，有效的荧光抑制需要相对较高的强度。因此，受激发射损耗显微镜最常用的方法是脉冲显微镜受激发射损耗光束(能够提供高峰值强度)，已渲染受激发射损耗设置既费钱又费力。此外，高的峰值强度可以在一些情况下，诱导的光损伤。通过这种需求的驱动下，它已经表明，受激发射损耗显微镜也可以实现连续波(连续波)梁。通过使用连续波激光，可以大大简化实现，降低成本和峰值强度。然而，CWSTED到目前为止还没有达到与脉冲激光器相同的空间分辨率受激发射损耗配置。在这里，我们提出两种简单而互补的方法来克服的缺点连续波-受激发射损耗我们同时利用了荧光标记能够自发发射的区域随着时间的推移而缩小这一事实受激发射损耗奇异激发事件后的光束作用[1.]和受激发射变得过渡通过使用更有效的受激发射损耗波长接近荧光标记发射峰值的光束[^2.].使用连续波受激发射损耗光束结合脉冲激励光束和时间门控检测使我们提高了有效的分辨率连续波-受激发射损耗和/或降低受激发射损耗给定分辨率的样本的强度。

Hans van der Voort，科学体积成像有限公司，荷兰

图像恢复的目的是优化利用显微镜提供的数据来恢复被成像的物体，换句话说，就是“弄清楚显微镜到底想告诉我们什么”。为了达到这个目的，成像过程所引起的畸变需要尽可能地消除。其中最重要的畸变是衍射的分辨率限制效应。在大多数显微镜类型中，衍射导致一个硬极限，在这个极限下，高空间频率(与物体的精细细节相对应)被传输到图像上。通过反褶积恢复物体的成功率取决于该限制通带区域的3D形状和范围，在通带区域以外恢复丢失频率的需要和成功率，以及物体本身。

这个受激发射损耗显微镜不仅可以在很大程度上扩展共焦系统的实际带通区域，而且至少在理论上，它还可以消除硬极限。没有硬极限似乎会使光学系统产生反卷积受激发射损耗数据采集是一项简单的工作，与原始数据相比可能具有巨大的增益分辨率，受噪声级的限制受激发射损耗由于每个像素可用的光子数量有限，数据往往较高。还有两个问题阻碍了成功：点扩散函数形状不仅取决于光学的稳定因素，而且还取决于更易波动的因素，如激光功率和样本本身。此外，热漂移通常会导致PSF下降因变形而变形。

在这次演讲中，我们将回顾衍射在共聚焦显微镜中的影响，衍射对不同类型显微镜的分辨率和带宽限制是如何相关的，以及如何受激发射损耗显微镜打破了这些限制。

随后，我们展示了如何构造反褶积方法，以及如何规避衍射限制。最后，我们展示了如何在实际问题受激发射损耗以上概述的成像可能会被克服，使其有可能获得显著的分辨率和对比度增加与大多数常规方式受激发射损耗数据。