迄今为止的脑成像方法
迄今为止，绘制大脑图谱的方法有限。由于组织的光散射，传统的多光子显微镜深层组织成像被限制在1毫米左右的组织深度。为了研究位于中心的大脑结构和细胞网络，必须对样本进行小体积的切片和研究。单个神经元投影需要在多个切片样本中进行跟踪。这是精心设计的。新的工具不断被开发:自动化切片方法减少了繁琐的工作，最大限度地减少了组织损伤，新的软件便于分析和重建。然而，重建对于神经元回路的详细分析可能并不总是可能的或充分的。新的光学清除方法使用有机溶剂减少光散射和图像深入组织。但这些方法使脂质双分子层完好无损，因此它们仍然具有扩散屏障的功能。光和大分子对全挂染色方法的渗透仍然有限。
如何让大脑变得清晰
清晰(透明脂交换丙烯酰胺杂交刚性成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶的首字母缩写)既简单又聪明。完整的组织被转化为水凝胶-组织的混合体。类似于石化或石化，组织的物理结构保持完整，防止解体。光散射脂质被去除，而蛋白质和核酸被保留，因为它们与水凝胶网以共价连接。
在第一步中，将组织注入丙烯酰胺/双丙烯酰胺、甲醛和4°C的热敏起始剂(图2)。甲醛交联组织，并将水凝胶单体共价连接到蛋白质和核酸上。缺乏官能团的脂质和生物分子不能结合，因此可以被去除。通过这种方法，只有8%的蛋白质丢失(与传统的固定和增溶相比，有25 - 40%的蛋白质丢失)。当温度升高到37°C时就会引发聚合。组织现在是水凝胶的混合体。网状结构支持组织结构，其纳米孔允许大分子进入。
脂质双分子层被电泳组织清除(ETC)除去。在定制的电泳室中，样品被放置在离子洗涤剂(4% SDS，十二烷基硫酸钠)中，并施加电场。高电荷离子sds胶束能有效去除脂质。与标准有机增溶性相比，ETC具有两大优势:
- 它不像许多有机溶剂那样猝灭荧光。
- 去除脂质很快。被动扩散洗涤剂需要几个月才能完全去除脂肪。
通过将澄清的大脑安装在折射率指定的溶液中，比如甘油或FocusClear®完整的大脑变得完全透明，可以进行成像(图2B)。
图2:CLARITY方法的描述:步骤1:组织在4°C下注入丙烯酰胺/双丙烯酰胺、甲醛和热敏启动剂。步骤2:甲醛将组织交联，并将水凝胶单体共价连接到蛋白质和核酸上。脂质双分子层被电泳组织清除(ETC)除去。
全脑成像
所有经典的激光扫描显微镜技术都适用于成像经过clarity处理的组织，因为每个激发和发射波长都可以穿透组织深处。
成像深度主要受物镜工作距离的限制。3.6毫米的物镜需要两次脑部扫描:首先是背部，然后是腹部。远距离物镜可以一次性成像整个器官。在2013年的神经科学学会年会上，徕卡微系统公司展示了最新的物镜发展:一种特殊的CLARITY物镜，配有电动矫正项圈，可188金宝搏的网址在最大成像深度和最高分辨率下进行全器官成像，将于2014年上市。
成像技术 |
一般原则 |
优势 |
限制 |
单光子共聚焦显微镜 |
用共焦针孔去除失焦光实现共焦 |
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双光子显微镜 |
由两个波长约为单光子激发所需波长的两倍和能量的一半的光子激发。不需要针孔。 |
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表1:适用于CLARITY的成像技术。
一个充满新可能性的世界
让CLARITY如此令人兴奋的是，你可以在一个大脑里研究任何你想要的东西。蛋白质复合体、基因表达谱、神经元回路——你不需要决定你想看什么。看看这一切，一个接一个。
纳米多孔水凝胶网对大分子是可渗透的，并允许探针的快速扩散。抗体染色很容易，甚至在多轮。复合物的稳定结构允许抗体被SDS冲洗掉。与使用有机溶剂的传统洗脱方法相比，后续染色的荧光不淬灭。即使在连续3轮染色和去染色后，图像质量也没有损失(图3和视频)。
通过大脑很长一段距离追踪轴突投影是可能的。显示成对的突触前和突触后蛋白质的共定位甚至允许对单个突触进行研究。在使用经典荧光显微镜后，组织仍然适合用电子显微镜来更仔细地观察细胞结构。
这种方法并不局限于新鲜的脑组织。它还成功地用于长期固定的人体解剖脑组织或斑马鱼胚胎，为研究神经疾病或胚胎发育开辟了新的可能性。
CLARITY提供了结构和分子信息，并增加了对大规模完整生物系统的理解。简而言之，CLARITY彻底改变了基础研究。
关于如何适应CLARITY的详细信息和说明可以在http://clarityresourcecenter.org/．
