差分干扰对比(DIC)

神经元,在dic neuronen_dic.jpg中成像

差分干扰对比(DIC.)显微镜是对BrightField显微镜的替代方案,用于获得未染色的标本的适当图像,这些标本通常只在明场中提供弱图像。

与偏振光的浮雕形象

未染色的标本经常出现在明菲尔德显微镜中的细节不起眼。但实际上它们与醒目的光相互作用,并且发生的相移不会被人眼无法检测到。染色会导致幅度偏移和通过通过光的强度的差异,但大多数情况下,这仅适用于死亡材料。DIC.显微镜是一种在光路长度和相移中使用梯度的技术,以在光显微镜下可见相位对象。以这种方式,可以使用足够的对比和分辨率观察活细胞和生物。

由a制作的图像DIC.显微镜是浮雕的,似乎有一个阴影铸造。由于光学切片的可能性,它们没有晕圈伪像并且也可以成像相对较厚的样本。

DIC.显微镜,仅用于偏振光来照亮样品。偏振光分散在两个不同的光线中,具有正交的极化平面。这两个光线彼此极近。由于它们在样品中经历不同的折射或散射,因此发生不同的相移。如果这些光线团聚,它们会互相干扰。光现在椭圆偏振。可以通过分析仪将该偏振变为幅度移位。以这种方式,可以使得可以看到高达1/200波长(或甚至使用相机的波长)和整个波长之间的波长差的相移。

光波的振荡

在非偏振光中,光波在传播的轴上沿各个方向振荡。然而,在线性偏振光束中,所有光波的振荡都具有相同的角度或偏振平面。圆极化是另一种可能的偏振形式。光波的振荡沿着圆形运动,具有稳定的绝对值,而方向随着恒定的角速度而变化。椭圆偏振光是线性和圆偏振光的混合物。

偏振光可以通过称为偏振器的装置生产。如果用于确定振动平面,则类似组件称为分析仪。有吸收和光束分裂偏振器。

在DIC显微镜中的光路

在一个DIC.显微镜,偏振光通过冷凝器前面的偏振器生产。该偏振光被分成两个线性偏振光光线,通过通过垂直的偏振平面分开DIC.棱镜更好地称为沃拉斯顿棱镜。沃斯顿棱镜可以在冷凝器的平面中找到。标准的Wollaston Prism是由双折射材料的两个楔形物构成,所述双折射材料在它们的基部上粘合在一起,并且具有与外表面平行的光学轴并且彼此垂直。

通过这种棱镜的偏振光被剪切到具有不同的偏转角度,普通和非凡波的两个紧密间隔的波。它们具有垂直的偏振平面,并且对于这两个波,介质的表现得像它具有单一有效折射率。波前的剪切发生在两个棱镜之间的折射率连接处的干涉平面处发生。光波通过剪切角在空间上分离。它们的方向和它们之间的距离对于整个棱镜的所有匹配光波都是相同的。这两个波之间的空间必须小于显微镜的分辨率限制。

因此,样品通过与横向位移的平行的紧密间隔的光波进行照亮。如果这两个光波以不同的折射率或不同的厚度与样本部件相互作用,则它们从样本中出现的光路长度会有差异。光路长度是折射率的乘积和光学路径上的两个点之间的厚度。它与过境时间和光速相关。由于光路长度与光的传输时间有关,因此在两个匹配的光波之间发生相移。

在光波穿过样品之后,它们通过另一个沃斯顿棱镜带回来。现在它们互相干扰,形成椭圆偏振光。椭圆偏振光通过分析仪。只有具有不同偏振平面的光能够通过并且因此为不同的光波产生不同的幅度。相移变为幅度移位,其导致所得到的图像中的不同光强度。

对于现代DIC.显微镜经常修改Wollaston Prism。一个例子是Nomarski棱镜。它由两个双折射楔子组成,但只有一个楔形股在沃斯顿棱镜中的一个楔子也是相同的。修改另一个,并且光轴倾斜地定位。这导致干涉平面,其位于棱镜外部。因此,棱镜可以位于目标的孔径平面之外,更易于使用。

DIC.显微镜检查相邻对象点的相移差异有助于图像形成。在其折射指数或其厚度中具有梯度的样本的细节被可视化。由于光束垂直于彼此偏振,因此可以通过旋转显微镜级来产生不同的图像。

重要的是要记住不要使用塑料DIC.显微镜检查,因为许多聚合物对光有脱极作用,并且会破坏对比度。

图。图4:来自光源的非偏振光通过偏振过滤器,并在45°处偏振。经过硅芳纶棱镜后,将光分离成垂直偏振组分,一个具有0°的垂直偏振分量,一个具有90°偏振的偏振件。冷凝器随后将光引导通过样品。样品由具有不同极化的两个相干平行光线照射。这基本上产生了样品的两个略微偏移的亮野图像,一个具有0°的一个,一个具有90°偏振光。由于光的偏振不同,这些图像不会干扰。分离的光线经历不同的光路长度,因为它们通过样品的点可能存在厚度或折射率的差异。这导致与另一个光线相移相移。在通过该目的之后,将垂直的偏振光重新组合于135°的偏振中。根据光路长度的差异,两条光线的干扰现在产生亮化或变暗,否则出现几乎不可见的结构。 Finally, directly transmitted light, which did not experience any phase shift, is removed by the polarizing filter with 135° direction (also called analyzer).

图6A-C:用差分干扰对比度记录的elegans(DIC.)和具有不同分裂角度的沃斯顿棱镜

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