癌症干细胞
肿瘤是一种异常组织，其生长和分化是由癌症干细胞维持的观点现在已被广泛接受为各种癌症疾病。癌症干细胞，作为它们的生理对手，拥有控制自己命运的能力，通过保持自己处于静止和未分化的状态，或通过自我更新以几何级数扩大它们的数量。第一种情况导致不对称分裂，产生两个完全不同的子细胞。第一个子代致力于通过多个细胞分裂和分化来产生组成组织(或肿瘤)的整个异质细胞群。第二种不进入细胞周期，并作为一个蓄水池在需要时能够自我更新。一个典型的刺激涉及到干细胞室的扩张，例如，对损伤的反应，例如，在造血干细胞的情况下，受损的骨髓的重新繁殖。在第二种情况下，干细胞以完全对称的方式分裂，产生两个具有相同的干细胞命运和增殖潜力的新细胞。
共聚焦显微镜定位干细胞
对干细胞生物学及其分子基础的理解在癌症研究中越来越重要。然而，干细胞室的代表性较低，例如在造血系统中约为1 / 1000，这使得群体平均技术，因为绝大多数的分子生物学分析(想想Western Blots)在大多数情况下都不适用。由于需要观察单个的、可能是活的细胞，荧光显微镜和共聚焦显微镜在干细胞研究中成为了无价的盟友。
在生物复杂性方面，需要用更具代表性的分析方法取代标准细胞培养，这导致了三维细胞培养技术的发展，以产生不同组织和器官的体外生物原型。在乳腺生理学和病理学领域，体外重建乳腺的能力是通过乳腺球的形成来衡量的（图1）。
在过去的几十年里，在理解人类中枢神经系统的本质方面有了许多重大的科学飞跃。这些发现中最突出的是化学突触的特征，它描述了神经元中一个高度特化的隔间。在这里，电脉冲转化为化学信号，将神经元电路中的信息传输到特定的靶细胞上。通过这种信号转换，可以通过增强或减弱传输效率来快速调制和处理信息。
纯化假定干细胞以非常低的密度被镀在特定的基质上，并通过活细胞显微镜观察它们的生长。在生理情况下，不对称分裂盛行，两个子细胞中只有一个进行了多次分裂[1]．转化的干细胞，就像来自ErbB2转基因小鼠的细胞一样，在乳腺上皮中表达激活的ErbB2致癌基因，消除了不对称分裂，倾向于产生具有自我更新潜力的多个积极增殖的细胞。
不对称有丝分裂具有特定的分子特征，其特征是某些分离决定因素的极化三维再分配，这些蛋白质在子细胞之间的不同分配决定了它们的干细胞命运。因此，共聚焦显微镜的光学切片能力成为重建如图2所示极性标记的体积定位的基础。在正常乳腺(A组)和癌症(B组)干细胞中，分离决定因子麻木的信号分布极为不同，证实了在转化时不对称分裂消失。
干细胞命运与周围的生理环境(干细胞生态位)之间存在着紧密的联系，这要求在活体或固定的厚组织切片中成像细胞，以维持自身的组织结构。因此，双光子显微镜现在正大规模进入这一领域。非线性荧光激发的贡献在体外研究中也可能是非常相关的。成熟的乳腺球厚度可以超过100微米，这对传统的共聚焦成像提出了相应的挑战。
通过对果蝇NMJ的突触结构和组装[4][5][6]的研究，突触前电子致密结构被命名为“Tbars”(由于其在电子显微镜下的特征形状)，显示包含brchpilot (BRP)。BRP被认为作为突触前支架蛋白在信号转导中发挥作用。通过应用发生的该技术与现有的成像技术协同结合，获得了关于大约250 nm大小的t形棒及其邻近结构的有价值的信息。
从结构分析到in活泼地刻画
除了增加穿透深度外，使用红外脉冲源成像在功能显微镜分析中提供了卓越的性能。同时吸收两个低能量子打开了激发荧光的可能性紫外线范围，甚至在相关深度，使多种内源性表达的代谢产物（如NADH）的空间分布可见并可量化，NADH是细胞糖酵解活性的相关读数。通过光谱分析浏览发射光光谱的能力允许同时量化在相同光范围内激发的不同分子源的荧光，如图3所示，其中NADH和黄素的贡献根据其光物理性质确定。
因此，非线性显微镜可以代表干细胞生物学领域的一场革命，将显微镜的作用从单纯结构分析的“简单”工具转变为根据细胞自我更新潜力进行体内功能表征的相关且独特的分析。
光活化蛋白质的巨大潜力
考虑到干细胞的低代表性，为了达到这一目标，有必要获得在生物复杂性不断增长的环境中识别干细胞的新方法。定位干细胞的代谢活动需要针对单个事件(在正常的乳腺球中)或最多几个事件(在肿瘤球中约5个)[1这些细胞的数量会随着待分析乳腺原型的成熟阶段而相应增长。
从这个角度来看，光激活探针具有巨大的潜力。荧光蛋白的特定变体，如paGFP、pamCherry，在其天然形式下具有惊人的荧光，但当用特定波长照射时，它们会经历结构修饰，从而改变其光物理行为。光转换的分子表现出极大的亮度增加，产生相应的光学对比度。点对点照明，典型的共焦显微镜，允许在空间上选择目标区域进行光激活。然而，使用传统的共焦照明，光转换的控制只能在二维中进行。
针对复杂生物样本中的细胞
聚焦高斯激光束本身并不产生光学切片，而是针孔空间滤波的结果。由非线性激发产生的固有光学约束反而使在选定的体积内对光活化过程的程度进行空间调制成为可能[2].将这一独特特性与增加的穿透深度相结合，可为复杂生物样品中的细胞靶向提供非常有效的工具。
光活化过程是不可逆的，在蛋白质降解发生之前，荧光会持续增加。通过对pamCherry-H2B组蛋白融合蛋白的初步观察发现，至少在细胞中有几次分裂，激活仍得以维持。因此，双光子诱导的光激活可以用于靶向选定的细胞，甚至将其作为一个新形成的复杂结构的乳腺球(图4)，从而通过监测残余光激活荧光随时间的变化来间接读取它们的增殖活性和自我更新能力。
