贴壁细胞传代培养工作流程
为什么我需要分裂我的细胞?
一旦细胞培养已经开始,由于细胞数量,营养消耗和有毒代谢物的增加,它不能无限种植,最终导致细胞死亡。此外,研究人员通常希望多次对其细胞进行实验,因此不想立即使用所有细胞。传递或分裂细胞,产生与原始培养更低细胞密度的新培养物。通过除去培养基并将细胞转移成新的生长培养基,给予细胞新鲜营养素,除去毒性代谢物,允许长期维持培养物。
在初始播种细胞之后,生长以滞后阶段开始,并进行到对数阶段,其中细胞呈指数级增殖,然后是生长速率和死亡率等于的固定阶段(图1)。在死亡阶段,由于营养成分和生活条件不足,细胞死亡。
为了保持细胞健康和积极生长,必须定期更新生长培养基和传代培养。根据细胞类型的不同,在对数期培养基的变化可多次发生。细胞传代的最佳时间是在对数期和固定期之间,在细胞达到融合之前。
为什么我需要检查我的细胞?
重要的是每天检查细胞培养,并在继代培养前立即监测细胞健康状况,检查污染,并确定何时分裂细胞。
首先检查培养基中的真菌污染,浊度和颗粒的培养,用培养基的颜色变化表明的培养基中的意外的pH偏移,可以通过眼睛进行宏观水平来完成。此后,应使用倒置显微镜检查一般细胞形态和生长模式的仔细检查。倒置显微镜的光学器件位于标本下方。由于细胞附着在盘的底部,因此可以从这种角度轻松地观察它们。应以100 - 200倍的总放大率进行观察相位对比,因为大多数小区难以在正常明亮的场照明中观察。
哺乳动物细胞形态有许多变异,但大多数培养的哺乳动物细胞可分为三类:成纤维细胞(中国仓鼠卵巢细胞(CHO))、上皮细胞样(人类子宫颈细胞(HeLa))和淋巴细胞样细胞(人类白血病细胞(HL60))。此外,某些细胞系可以有特定的形态特征,例如神经元(SH-SY5Y)有很长的树突过程。细胞形态也受到细胞生命周期事件的影响。在有丝分裂期间,许多细胞聚集在一起,形成可折射的明亮球体,这些球体可能漂浮在介质中。死亡的细胞经常聚集并脱落,但通常不明亮和可折射。
不同的细胞系不仅大小和形状不同,它们的生长行为也不同。它们要么贴壁生长(成纤维细胞和上皮细胞),要么悬浮生长(淋巴细胞样细胞)。大多数贴壁细胞系生长为单层(单层),附着在玻璃或处理过的塑料基底上(涂有聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原蛋白或明胶)。
我如何传代我的细胞?
制备亚培养物的细胞最常见的方法是用胰蛋白酶诱导蛋白水解酶破碎细胞间和细胞对基底连接。胰蛋白酶与乙二胺四乙酸(EDTA)组合使细胞与生长表面分离。胰蛋白酶切开将电池锚固到培养皿中的焦粘度,并且EDTA充当钙螯合剂。
通过去除钙,参与细胞间相互作用的钙粘蛋白被破坏,细胞彼此分离。一旦与生长表面和周围的细胞分离,它们可以很容易地分离和在新的细胞培养皿中生长。
细胞培养条件和传代培养方法对于每种细胞类型而变化。图2描述了子文化工作流程中的基本步骤。在整个传代培养过程中,重要的是在无污染环境中工作。在开始,在胰蛋白酶,细胞计数期间和分裂后的开始检查细胞是必不可少的。对于一致的结果,保持良好的记录和文件也很重要。
以下协议描述了在90mm培养皿中生长的Madin Darby犬肾细胞(MDCK细胞)的亚养殖程序的基本原理。这些是从狗的远端小管中分离的上皮细胞。在培养方案中,它们在达到汇合后坚定地生长并形成单层多边形细胞。
亚文化需要以下材料和设备:
材料:
- 预热培养基至37°C (MDCK细胞:MEM + 5%FCS.青霉素100 mg/mL,链霉素100 mg/mL)
- 没有加州的预热PBS2+/ mg.2+
- 预温0.05%胰蛋白酶,0.02% EDTA, D-PBS
- 台盼蓝(活体染色)
- 70%乙醇或异丙醇用于消毒
设备:
- 电池计数室
- 移液管/微肺纤维用一次性尖端
- 相对比度的倒置显微镜(徕卡DMI1.例如,)
- 个人保护设备
- 水浴设定为适当的温度
- 培养箱在37°C,5%CO2和高湿度
- 离心机
- Pre-labelled菜
分裂比是1:10。
用Leica DMI1进行的粘附细胞亚栽培的4步 - 工作流程
第1步:细胞检查
第2步:细胞收获
第三步:细胞计数
细胞浓度的计算公式如下:
步骤4:电镀