使用双光子励磁激光扫描显微镜的活细胞中PA-GFP的4D Photactivation

绿色荧光蛋白（GFP.）来自Aukorea Victoria [1[其主题的多色变化是用于生物可视化的最常规的荧光示踪剂[2]．兴趣在细胞内蛋白质活性和运动的更精确定位研究，我们可以说，新的革命开始于去除术荧光蛋白的出现[3、4]．蛋白质的荧光有效地在分子和细胞生物学研究中引起了“新光”[5,6]，“荧光工具箱”正在增长[7]使用光学显微镜，朝向大分子级分辨率的步骤正在成为现实[8]．在这个关键方案中，我们专注于PA-GFP.作为光激活荧光蛋白[3.]以及由共聚焦和双光子显微镜提供的不可或缺的工具[9 - 11]．电池内部的粒子跟踪很大程度上从空间和时间标记的特定结构中的能力遵循它们在“黑暗”背景上遵循其“黑暗”背景，因为自PA的出现以来GFP.。paGFP.在野生型中用组氨酸取代苏氨酸203的位点特异性诱变的结果GFP.。这导致优异的光可转换分子在405nm处的高能量通量照射后产生高达100倍的488nm励磁荧光，[3.]．通过共聚焦显微镜选择性的选择性光激活立即证明了PA-GFP.可以认为是研究体内蛋白质时空动态的最佳工具，如溶酶体和线粒体的跟踪[3、4]．同时，当人们用pa-来做实验时GFP.，第一关键方面与执行光谱指纹识别的能力有关[12]．当考虑到活细胞和组织中存在的“自荧光分子的海洋”时，这尤其有用[13]．

现在，在光激活过程的空间限制方面，使用双光子甚至多光子励磁[14,15]与单光子共聚焦显微镜相比，在标记生物结构被跟踪方面提供了几个有利的方面[16-18]．由于非线性要求，子离心机的幅度级的高度狭窄的激励卷提供了对励磁的独特控制，并且因此在3D空间中的光激活。

即使单光子共聚焦激光扫描显微镜可以有效地调制平面亚微米区域中的激励功率，它也不能引起沿光轴的相同控制，是延伸到物镜的整个照明锥的激励体积[16]．通过光激活生物分子标记标记生物胚胎中的特定细胞的能力可以为理解细胞命运和分化机制提供一种独特的工具，以了解细胞命运和差异机制[17]．

共聚焦激光扫描显微镜
单个光子拍摄测量测量为徕卡进行TCS.SP2共聚焦显微镜配有63×/ 1.40（油CS HC×PL7月）物镜（Leica），采用405nm线20 MWATT激光二极管。Pa-的成像GFP.通过488nm激光线获得预活化。用于收集荧光的光谱窗口跨越500至600nm。使用的主要通道是通道2。

双光子励磁
Ti：蓝宝石激光源直接耦合到徕卡的扫描头中TCS.SP2.a共聚焦显微镜通过红外端口。使用在焦平面上的

min = 2.5mw的平均功率来收集测量的焦点平面，用于两个光子诱导的光激活。使用20mM氩离子激光器的488nm线获得活化蛋白的成像。使用100x / 1.4收集图像（油HCX PL7月)目标。双光子激活过程遵循先前建立的程序[16]:首先将脉冲红外激光束聚焦到样品的λ = 750 nm区域;随后，用λ = 488 nm和

= 0.04 mW(目的后平面测量)激发未放大区域，观察活化蛋白。采集荧光的光谱窗口为500-600 nm，通道2。a和光谱单元用于在光活化过程之前和之后适当检查蛋白质发射光谱，图1。

在37℃，5％CO的标准培养条件下生长凤凰和HELA细胞₂在DMEM培养基中补充有10％北美胎牛血清（Gibco Europe，佩斯利，英国）。paGFP.是乔治·帕特森医生慷慨的馈赠HeLa瞬时转染使用FuGene (Boehringer-Ingelheim Italia s.p.a.， Milan, Italy)试剂根据制造商说明进行。48小时后收集细胞并固定。安装前，盖玻片用DNA染料TOPRO 3 (Molecular Probes Europe, Leiden, Netherlands)染色，以促进细胞鉴定。用pa-转染Phoenix细胞GFP.使用磷酸钙编码DNA。24小时后，细胞在冷1x PLC缓冲液中裂解（50mM HEPES，1.25％甘油，150mM NaCl，166mM MgCl₂，1％TritonX-100,0.001％EGTA，10mM萘磺酸盐，0.1mm NaortovanaDate，0.01mM PMSF，抑肽酶，胃蛋白酶和Leupeptin）1小时。将细胞裂解物与抗体一起温育GFP.多克隆抗体和随后用蛋白质是琼脂糖珠，用作幻影样品。对于成像，将珠子重新悬浮在含有Diazabidclo-（2.2.2）辛烷值的90％甘油溶液中（Sigma-Aldrich S.R.L.，米兰，意大利）。修饰的球体夹在乙醇/丙酮清洁盖滑动和载玻片之间。为避免干燥，用普通指甲油密封样品[16]．

类似于双光子激发的双光子激活，预计将是三维限制过程。这可以通过在含有PA-的人体样本中成像所选择的感兴趣体积来证明这一点GFP.或活细胞能够表达蛋白质。我们检查了光激活属性作为激活波长和功率的函数[16]使用PA-制作的幻影样本GFP.固定在珠子上。在488nm下最初激发绿色荧光以可视化预激活强度。然后通过将脉冲红外激光束聚焦在22μm上通过聚焦脉冲红外激光束来引入激活过程²区域(512 × 512像素)。在激活过程中，每像素停留时间在4.88 μs到几毫秒(ms)之间变化。随后，使用激活过程之前的采集参数对未放大区域进行成像。

图2显示了在用作幻影的PA-GFPSphere表面的不同条件下进行光激活的不同区域。分析激活之前和之后的图像以确定平均强度值。将活性区域的平均荧光强度的比率（c）作为光电转换过程的效率作为光激活波长，图3的效率。

由于局部受限的非线性激发概率，期望有限厚度的激活体积依赖于所提供的激光光强[14,15[但是单光子诱导的活化应沿着样品中的光的整个光束路径延伸。图4中示出了单光子λ= 405nm之间的比较和双光子活化过程。两光节活化体积的厚度限于电池内部的窄区域，而单光子激活结果轴向完全活化的单元。

在核内的光活化体积的强度分布I（x，y，z）如图5所示。强度分布也是所使用的功率的函数。激活体积的变化基于基于强度分布I（Z）的变化，该强度分布I（Z）的变化作为逆第四动力律作为距离，Z的函数，来自镜头的几何焦点。使用像激发波长的参数，数值孔径，样品的折射率，可以根据焦平面的距离来预测任意强度值[16]．

光激活后发射的荧光的强度表示活性和未激活的体积之间的边缘，因此可以被认为是用于确定激活过程参数的阈值指示符。随着激光能量的函数，活化体积的厚度增加。可以使用以下数据三元组报告每个像素[μs]，激活功率[MW]和FWHMI（Z）[μm]来概括不同体积的感兴趣的值。：（19.6,5,2.35）;（4.9,17,3）;（9.8,10,3.5）。

为了量化由于球体上不同区域的位置可能产生的错误，覆盖整个球体，使用相同的设置被激活。用488nm辐照后，荧光强度相差10%。这种测量强度值的不确定度是固有的，不会在统计误差之外显示出来。为了确定最佳工作效率，全激活谱是有用的。在我们的装置中，波长范围在720nm到920nm之间，涵盖了野生型已知的吸收截面GFP.并且至少是EGFP的吸收峰。为了获取光谱，考虑了依赖于波长吸收两个光子的不同概率（用于更高波长的功率校正）。

为了测量活化过程的成功或效率，荧光强度（用L = 488nm辐射）的比例在两次光子活化和之前被考虑。发现转换效率在830nm以上的波长（对于高功率和长次），转换效率显着下降（最重要的）[16]．此外，效率显示出720nm和750nm之间的波长的高水平。达到800 nm的另一种效率水平适用。不幸的是，以下值显示出强烈的波动，既不明确分配给前一级，也不应在这一点上进行低级效率的转让，无需进一步调查。

在目前的工作中，PA-的光物理性质GFP.已经概述了在多选激发的情况下，表明可以与蛋白质动态研究的光活化标记相结合使用双光子显微镜。paGFP.与405 nm处的光激活相比，双光子激发在远红波长范围内表现出相同的光转换特性:光子的吸收可导致488 nm处的吸收截面增加。这种效应可以有效地用于在整个细胞中标记亚微米区域，并逐例选择适当的感兴趣体积。研究激活的空间体积作为激发能的函数表明，强度调制可以有效地用于诱导沿光轴的空间控制的蛋白质光转换，这为动态识别单个三维结构和考虑最终的4D (x-y-z-t)过程提供了独特的可能性。

可以有效地使用双光子活化来跟踪细胞周期步骤后活细胞中蛋白质和其他生物大分子的命运，并且还可以追求在3D存储器方面的应用。值得注意的是，偶联具有非线性过程的高分辨率水平的生物样品中蛋白质的选择性表达产生了一种用于科学固定的强大工具。此外，在光和蛋白质之间的相互作用中涉及的非线性过程的利用可以导致大分子分辨率水平，同时保持使用光学显微镜的优点[8,19,20]．

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