상처치유분석(伤口愈合试验)은스크래치분석또는이동분석의동의어로도자주불리며,단일세포또는세포개체군의이동평가및측정에중요한도구입니다。세포이동은발생과정동안엄격히통제되지만때때로암발생및진행으로인해통제를벗어날수있습니다。
세포이동과관련된중요한질문은다음과같습니다。
- 특정약물이세포의이동속도를어떻게변화시키는가?
- 특정조건에서세포가얼마나빨리이동하는가?
상처치유(伤口愈合)실험
상처치유실험을수행하는기본절차는상당히명확합니다。100%채워진세포단층에인위적으로세포가없도록간극을만든다음이간극을닫는세포의능력을모니터링합니다。
신뢰할수있고재현가능한결과를얻으려면수많은매개변수를고려하고표준화해야합니다。다음섹션에서세포모니터링에관한몇가지일반적인측면을다루면서PAULA가워크플로우작업을단순화하는데어떤도움을주는지알아봅니다。
적절한컨트라스트방법
표준명시야(Brightfield)현미경설정에서대부분의세포단층은비교적탐지하기어렵고심지어"보이지않기도합니다”。위상차(相衬)를사용하면세포”모”양이강조되어세포를쉽게찾을수있습니다。그러나수동현미경에서위상차를사용하도록설정하는것은특히숙련되지않은사용자에게는번거롭고시간이오래걸리는작업일수있습니다。일반적으로형광은이동에관한추가적인요소들을모니터링하는데사용합니다。그러나이방법을표준컨트라스트방법으로사용해서는안됩니다。광퇴색(光漂白)과광독성(光毒性)이세포의이동에상당한변화를야기할수있기때문입니다。
- PAULA는미세조정이필요없는무조정(alignment-free)위상차를제공합니다。
- 클릭한번으로위상차를활성화할수있습니다。
- 필요한경우형광대조(빨간색/초록색발광,예:GFP및域라벨링세포등)를추가할수있습니다。
100%채워진세포층을이용한상처치유(伤口愈合)분석
적절한타임포인트를찾는것이중요합니다。대부분의경우상처치유분석100%은채워진세포층을이용하여이루어집니다。세포가100%채워진상태에도달한상태에서세포가계속자라도록두는경우,세포가떨어져나오거나인접한세포가억제될수있습니다。따라서적절한타임포인트를찾아상처치유분석을시작하는것이성공적인실험을수행하여의미있는결과를도출하는데필수적입니다。
- PAULA는원하는세포컨플루언시에도달하면이메일을통해알려드립니다。
- 앞으로는세포배양실에가서수동으로세포를확인하지않아도됩니다。
- 이제상처치유(伤口愈合)실험을시작할완벽한순간을찾으실수있습니다。
최적의환경조건이중요합니다
”상처치유분석은데드엔드(死胡同)”분석을통해이루어지곤합니다。간극이완전히닫혔는지확인하기위해서는세포플라스크를인큐베이터에서꺼내어세포를수동으로검사해야합니다。이러한접근방식은시간이많이소요되고정확하지않습니다。대안으로세포플라스크를클라이밋챔버에장착된현미경스테이지에그대로둘수도있습니다。원칙적으로이러한방법도잘작동하지만온도와二氧化碳변화를완전히배제할수없습니다。그렇다면가장좋은환경에세포를계속두는것은어떨까요?이는세포배양에가장최적화된환경조건을가진인큐베이터안을뜻합니다。
- PAULA는세포를최적의상태로유지하는일반세포배양인큐베이터안에둘수있습니다。
- 며칠이지나도초점이유지됩니다。재조정이필요하지않습니다。
- PAULA는타임랩스기록을통해현재이동속도와간극닫힘비율,50%닫히는데까지걸리는예상종료시간을즉시계산합니다。
- 세포상태와결과를어디에서나지속해서모니터링할수있습니다。
일관된간극크기가중요합니다。
대부분의경우세,포단층의무세포간극은피펫팁을사용하여수동으로만들어집니다。스크래치크기는주로단층표면에가해지는압력에따라달라집니다。그러나재현가능한결과를얻으려면일관된스크래치크기가중요합니다。
- PAULA에통합되어있는자로정확한세포간극너비를확인하실수있습니다。
- 여러플라스크에서비교가능한간극크기를보다쉽게찾으십시오。
- PAULA는ibidi와같은인서트로유도된무세포간극에도사용할수있습니다。
재현성에중요한기타파라미터
간극크기및환경조건외에도상처치유(伤口愈合)분석의재현성에영향을미칠수있는요소가더있습니다。예를들어이미지및촬영설정,시스템보정과같은기술파라미터와세포패시지넘버(通道号)와같은표본조건이있습니다。PAULA는두가지유형의파라미터를모두모니터링합니다。
- PAULA는세포의패시지넘버를기록할수있습니다。이방법을통해유사한세포상태를비교하고있는지(사과를사과또는오렌지와비교)를알수있습니다。
- 조명과같은파라미터미세조정을비롯하여특정표본에사용되는모든개인설정을떠올려보세요。
- 이제는시스템에서해야하는추가보정이필요하지않습니다。
상처치유분석쉬운설정
상처치유분석설정이간단하고반복하기쉬워지면결과의재현성이훨씬높아집니다。PAULA를통한상처치유분석설정이얼마나쉽고배우기쉬운지직접확인해보세요。성공적인상처치유실험을시작하는데에는단3단계만이필요합니다。
- 표본정의
- 타임랩스정의
- 관심영역정의
결과산출
실험이종료되면결과가산출됩니다。
- PAULA가시간경과에따른간극닫힘값과이동속도를그래픽으로표시해드립니다。
- 간극및속도계산에사용할타임포인트를임의로정의할수있어스크래치경계면에서죽어가는세포의효과를제거할수있습니다。
- 간극이50%및100%닫힐때까지의시간을예측한다음,이시간에도달하게되면실제값을계산합니다。
- 모든데이터를목록에표시하고엑셀파일로내보낼수있습니다。